基于碳氮稳定同位素比值和UPLC-QOrbitrap 代谢组学技术的有机奶和普通奶的成分差异研究

聂雪梅，谢 昀，许博舟，许秀丽,

（1.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京 100176；2.国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100176）

乳业是健康中国、强壮民族不可或缺的产业[1]，随着消费者收入水平的提高，人们对牛奶品质的要求越来越高，纯天然、无污染、安全健康的有机奶得到了消费者的青睐，因此有较高的安全性和经济价值，但受利益驱动，一些不法商家随意标注“有机”字样来对食品采取假冒、伪造、以次充好等方式欺诈消费者，因此对有机奶和非有机奶中差异性成分的研究非常重要。有机乳制品甄别目前主要集中在产地的认证和安全指标的检测，但仅依靠产地有机认证的信息不能完全保证有机奶的真实性，目前尚无有效的检测方法对有机奶和非有机奶进行精准鉴别。

在有机产品真实性鉴别方面，稳定同位素质谱技术可用于鉴别不同种类和来源的食品，是国际上目前用于鉴别食品成分和掺假的一种有效工具，并在有机乳[2-3]、葡萄酒[4]、蜂蜜[5-6]、果汁[7-8]等食品的鉴别方面有所应用。葡萄酒、蜂蜜和果汁中掺假的问题，由于添加物与天然糖中13C/12C、15N/14N 比值的不同，因此通过稳定同位素比值质谱技术可以比较明显地区分出来。但有机乳与普通乳的区别在于有机牧场和普通牧场饲养方式不同，影响13C/12C、15N/14N 比值的因素较多。除不同牧场饲料差别外[3]，同一牧场奶牛冬天食用玉米，夏天食用草或豆科植物，稳定同位素C 和N 比值也会随着饮食的季节不同而有变化[9]。此外，采样时间和地理位置也会影响稳定同位素C和N 的比值[10]，因此仅通过一种检测手段很难满足精准分析。

代谢组学近年来在动植物疾病诊断、生物标志物筛选、物质毒性毒理研究、中医药等多个领域得到了广泛应用[11]，对食品中代谢小分子也可以进行定性和定量的分析，从而动态呈现出机体内代谢物的变化，代谢组学常用的研究方法主要包括气相色谱-质谱联用法[12-14]、质子核磁共振法[15-16]和超高效液相色谱-串联四极杆质谱法[17-19]等。已有相关报道代谢组学用于不同泌乳期乳制品的代谢物差异物分析[20-21]，其中超高效液相串联-四极杆静电场轨道阱质谱更具有高灵敏度、选择性强、重现性好等优点，目前被广泛应用于代谢物测定、中药组分分析鉴定研究，康佳欣等[22]采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱非靶向代谢组学方法对萨能奶中山羊初乳和常乳进行了代谢组学分析，发现有118 种代谢物与常乳存在差异，主要是脂质类、氨基酸类、核苷类等。也有文献表明通过稳定同位素氮和高分辨质谱结合的方式可对有机番茄进行鉴别[23]，因此本论文也将首次尝试将稳定同位素比值、超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Orbitrap）及化学计量学相结合的分析技术对有机奶进行研究，旨在揭示有机奶和普通奶之间的差异性，为有机牛奶的真实性筛选提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

泌乳早期有机牛奶（30～90 d）、泌乳晚期有机牛奶（210～270 d）、普通牛奶 内蒙古的有机奶饲养基地和普通奶饲养基地，每批次牛奶从挤奶场随机取样，经分析剔除掉不符合牛奶（经代谢组学分析个体差异较大为不符合牛奶），共有63 个样品，其中有机奶包括17 个泌乳早期奶，22 个泌乳晚期奶，普通奶包括24 个，所取的牛奶混合均匀，具有代表性；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、锡杯（9 mm×5 mm）、CN 反应管 美国Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸 质谱级，J&K 科学有限公司；实验室用水 实验室自制；IAEA600 咖啡因（δ13C=-27.271‰，δ15N=1‰）国际原子能机构。

Delta V 同位素比质谱仪、Flash EA2000 元素分析仪 美国Thermo-Fisher 公司；Q-exactive 高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨率质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific；Milli-R04 纯水仪 德国Millipore 公司；ML104/02 分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司；HSC-12B 针式氮吹仪 天津恒奥科技有限公司；旋涡混合仪 德国IKA 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 同位素质谱测定方法

1.2.1.1 同位素质谱样品的制备 将鲜牛奶混匀后，冷冻干燥成粉末，过20 目筛放于-80 ℃备用。

1.2.1.2 样品中碳氮同位素比值分析 冻干成粉末的样品，分别称量约150～180 μg，并用锡杯密封包裹成球，每份样品重复3 次，测定稳定碳同位素比值。冻干成粉末的样品，分别称量约3000～3200 μg，并用锡杯密封包裹成球，每份样品重复3 次，测定稳定氮同位素比值。

1.2.1.3 同位素比质谱仪参数 离子化方式：EI 离子源，离子源电压：3.06 kV，真空度：1.5×10-6mbar。氦气压力：4 bar，氧气压力：4 bar，二氧化碳压力：4 bar，氮气压力：4 bar，空气压力：8 bar。

1.2.1.4 元素分析仪参数 元素分析仪氧化炉最高温度为980 ℃，载气氦流量为100 mL/min，氧气流速为175 mL/min；氦气吹扫气为180 mL/min，柱温为50 ℃。

1.2.1.5 碳氮同位素比值测定 元素分析-同位素比质谱（EA-IRMS）分析结果以δ表示，它反应了样品和国际标准物质之间同位素丰度比的相对差异：

其中，R 代表13C/12C 或15N/14N 的同位素含量比，SPL 与STD 分别代表样品和标准物质；δ值用千分数表示（‰）。

表1 有机奶和普通奶样品δ13C 和δ15N 值对比Table 1 δ13C and δ15N in organic milk and ordinary milk

1.2.2 高分辨质谱测定方法

1.2.2.1 高分辨质谱样品前处理 前处理方法参考相关文献[24-25]，将鲜牛奶称量约2 g，加入 10 mL乙腈，超声提取30 min 后，加入3 g NaCl，在4 ℃下10000 r/min 离心10 min，取5 mL 上层提取液，在40 ℃下氮气下吹至近干。残渣加乙腈1 mL 进行复溶，过0.22 μm 滤膜，放置于2 mL 液相进样瓶中，待测。

1.2.2.2 高分辨质谱仪器参数 液相色谱条件[26]：色谱柱Accucore aQ（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）；流动相为A 为有机相乙腈，流动相B 为水溶液（0.1%甲酸，v/v）；流速0.3 mL/min；进样体积为5 μL，柱温40 ℃；流动相梯度洗脱程序：0～0.5 min，5% A；0.5～5 min，5%～30% A；5～10 min，30%～100% A；10～12 min，100% A；12～15 min，5% A。

质谱条件：离子源为加热电喷雾离子源；喷雾电压为3.5 kV；离子传输管温度为320 ℃；全扫描-数据依赖二级扫描模式，一级分辨率70000，二级分辨率17500，实验中所用的气体均为高纯氮气，质量扫描范围（m/z）为100～1500，监测模式：正离子监测模式。

1.3 数据处理

通过Xcalibur 软件进行原始数据采集，将原始数据导入Compound DiscoverTM3.0 软件，对总离子流图中的色谱峰提取、峰对齐、匹配分析等，质荷比范围为m/z 100～1500；峰相应强度最小值1×10-6。同时将数据矩阵提取出来的数据信息利用SIMCA-13.0 软件进行标准化归一化处理，并进行正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA），根据VIP（VIP＞1）和组间变化的显著性（P＜0.01）进行有机奶和普通奶的差异性代谢物的筛选。

2 结果与分析

2.1 有机牛奶和普通牛奶稳定碳氮同位素比值的分析

利用元素分析仪共测定39 个有机奶和24 个普通奶，表1 为有机奶和普通奶的δ13C 和δ15N 值对比。

2.1.1 有机与普通牛奶稳定碳同位素比值的分析通过碳同位素元素分析仪测定63 个有机奶和普通奶，对比分析了有机奶和普通奶的δ13C 值，39 个有机奶样品的中位值δ13C 为-27.46‰；24 个普通奶的δ13C 中位值为-27.36‰，有机奶和普通奶δ13C 值有部分交叉，但有机奶和普通奶的单因素方差分析P＜0.01，从结果的平均值分析，有机奶的δ13C 值的整体情况比普通奶的δ13C 值更偏负，这与赵超敏等[2]有机奶粉所研究的结果一致，δ13C 值反映了奶牛饲料中C3 植物与C4 植物的比值，理论上有机牛奶的奶牛是食用天然牧草长大的，这些牧草主要都是C3 植物[27-28]，C3 植物的δ13C 值变化范围为-23‰至-35‰之间，普通牛奶的奶牛主要食用的玉米属于C4植物，C4 植物的δ13C 值变化范围在-9‰至-19‰之间，因此从理论上分析，有机奶的δ13C 应该比普通奶更偏负。但由于有机奶的奶牛所食用的并非只有有机牧场的牧草，还包括其他进口燕麦等一定比例的饲料，且存在其他含有C 元素的物质对结果有影响，所以导致有机奶和普通奶的δ13C 数值有交叉，但是从单因素方差分析P＜0.01，说明存在显著差异，因此碳稳定同位素比值可以作为区分有机奶和普通奶的一种技术手段。

2.1.2 有机奶与普通牛奶稳定氮同位素比值的差异分析 通过氮同位素元素分析仪测得63 个样品数据，共计39 个有机奶和24 个普通奶，对比分析了有机奶和普通奶的δ15N 值，有机奶的δ15N 的中位值为3.40‰，普通奶的δ15N 的中位值为2.81‰。有机奶和普通奶的δ15N 具有显著的差异（P＜0.01），从δ15N 平均比值来分析，有机奶中δ15N 比值明显高于普通牛奶，王世成等[23]所研究的有机番茄中氮同位素比值明显高于普通番茄，两者结论较为一致，δ15N值反映了奶牛饲料中15N 与14N 的比值，理论上来说有机牧草不允许使用人造肥料，有机牧场的奶牛所食用的饲料主要为有机牧草，有机牧草中高含量的15N 使有机奶中15N 比例增高[23]，而普通牧草的种植允许使用化肥，因此牛奶中氮同位素比取决于土壤中的氮源，有机奶中δ15N 比值明显高于普通牛奶，氮同位素比值也可以作为区分有机奶和普通奶的一种技术手段。

2.2 液相色谱高分辨质谱分析有机牛奶和普通奶组成成分

2.2.1 UPLC-Q-Orbitrap 谱图分析 采用正离子模式对有机奶和普通奶进行分析，图1 为有机奶和普通奶的总离子流图，由图1 可知，谱图基线较为平稳，说明仪器有较好的稳定性，图像可信度较高，有机奶和普通奶的原始数据经过Compound Discover 软件降噪后进一步分析研究，提取了所有化合物的质谱信息，共提取1682 个化合物，下述分析以1682 个正离子检测进行研究。

图1 普通奶（A）和有机奶（B）单个样品的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram for a random single ordinary milk (A) and organic milk (B)

2.2.2 液相色谱-高分辨质谱的主成分分析 将有机奶和普通奶的1682 种化合物信息导入SIMCA-P 软件，进行PCA 主成分分析，用以判别有机奶和普通奶之间的差异，但PCA 不能很好地将两种牛奶分开，由于PCA 无监督分析方法存在组内的误差和无关的随机误差，所以本研究采用了有监督的判别方法OPLS-DA（正交偏最小二乘-判别分析）进行代谢差异物的筛选，OPLS-DA 不同于PCA，运用正交偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本类别之间的关系模型，来实现对样本类别的预测，能够更科学|更客观的区分代谢物的组间差异。如图2 所示，有机奶样品主要分布在该置信区间的左侧，普通奶样品主要分布在置信区间的右侧，有机奶和普通奶样品区分效果佳。本次OPLS-DA 模型分析得到2 个主成分，该模型的参数R2和Q2分别为0.997 和0.709，均大于0.5，说明该模型稳定性可靠。从图2 可以看出不同的样品分布在不同的象限，普通奶差异较小，聚集在一起，而有机奶差异较大，较为分散，这是有机奶中包括不同泌乳期的有机牛奶的缘故，该结果表明有机奶和普通奶的代谢成分在种类、数量和含量上存在显著的差异。

图2 有机奶和普通奶样品的OPLS-DA 得分图Fig.2 Score plot of OPLS-DA between organic milk and ordinary milk

由于有机奶依据泌乳期分为泌乳早期奶和泌乳晚期奶两种，因此同时对不同泌乳期和普通奶进行差异分析，如图3 所示，有机泌乳早期奶和有机泌乳晚期奶与普通奶分布在不同的置信区间，区分效果佳。但是有机泌乳早期奶活性成分差异较大，样品点较分散。本次OPLS-DA 模型分析得到2 个主成分，R2和Q2分别为 0.928 和0.773，均大于0.5，说明该模型稳定性可靠。这结果也表明不同泌乳期的有机奶其含量、种类和数量相差较大，但能够与普通奶有所区分。

2.2.3 有机牛奶和普通牛奶差异性组分的分析 通过Compound Discover 软件分析共有1682 个化合物，对有机奶和普通奶间数据峰面积均值进行比对形成S-PLOT 图（图4）。在S-PLOT 图的右侧象限为普通奶的代谢物，左侧象限为有机奶的代谢物，距离中心原点越远的代谢物表示在两者之间的差异越大，从图上可以看到，有机奶中的差异性化合物种类远远多于普通奶，通过Compound Discover 软件匹配mzcloud、chemspider 等数据库，识别了294 个化合物的信息，如保留时间、分子量、一级质谱碎片和二级质谱碎片等，并查阅了相关文献，进一步确认相关化合物的信息，从结果分析，牛奶成分中除了乳糖、葡萄糖等糖类，肌酸、氨基酸等有机酸类，还包括饲料里产生的葛根素，以及次生代谢物胆碱等，另外还有环境暴露的一些化合物例如塑化剂等。

图4 有机奶和普通奶的S-plot 图Fig.4 S-plot of organic milk and ordinary milk

其中含量较高的包括α-乳糖，普通奶中的乳糖含量是有机乳中的1～2 倍，这与Wu 等[29]的研究是一致的。胆碱在有机泌乳早期奶含量较高，是普通奶中的2 倍左右，肌酸在普通奶中含量是有机奶中的1～2 倍，异亮氨酸在有机奶中的含量是普通奶中的2～3 倍。

经过Simca-p 筛查共发现651 种VIP 值大于1 的物质，同时依据t检验（t-test）的P值（P＜0.05）筛查差异性代谢物，经与数据库匹配确证发现，以下5 种化合物成分在有机和普通牛奶中在含量、数量上存在较大差异（见表2），有机泌乳早期奶中组氨酸含量高于普通奶的138 倍，有机泌乳晚期奶组氨酸含量高于普通奶的22 倍，其他4 种物质包括2,6-二氨基甲苯、3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺、6-正己基氨基嘌呤、二乙烟酰胺含量也均高于普通奶。

表2 有机奶和普通奶样品部分差异物Table 2 Partial different metabolites of organic milk and ordinary milk

2.2.4 有机牛奶和普通牛奶代谢物成分层次聚类分析 热图是对实验数据分布情况进行分析的直观可视化方法，可通过颜色深浅和差异来直观展示研究对象的差异，并对样品进行聚类分析（见图5A 和图5B），在图5A 中右侧为有机奶，左侧为普通奶，从图5A可以看出右侧有机奶中代谢物较多，且有机奶和普通奶组数据分别能够较好的聚集在一起，说明代谢物聚集效果良好。由图5B 可以看出6-正己基氨基嘌呤、2,6-二氨基甲苯、组氨酸、3,5-二甲基吡唑-1-甲酰胺、二乙烟酰胺在有机泌乳早期奶中含量较高，在有机泌乳晚期奶中含量较低，而胆碱在有机泌乳早期奶含量较高，α-乳糖、肌酸等在普通奶中的含量较有机奶中要高一些，尤其是有机泌乳早期奶中含量很低，这与吕牧军等[30]研究结论一致，常乳的乳糖含量比初乳高。总体来说，有机奶中代谢物数量大于普通奶中代谢物的数量，尽管部分化合物在有机泌乳早期和晚期也不尽相同，但通过上面5 种差异较大的代谢物可将有机奶和普通奶进行区分。

3 结论

本文采用稳定同位素比例质谱和高分辨质谱两种分析技术共同对有机奶和普通奶进行差异性的分析研究。首先通过对有机奶和普通奶进行C 和N 同位素平均比值分析，有机奶的δ13C 比普通奶更偏负，有机奶中δ15N 比值明显高于普通奶，从统计学意义上分析，由于单因素方差分析P＜0.01，因此具有显著性差异，说明碳氮稳定同位素比值可以作为区分有机奶和普通奶的一种技术手段。其次结合UPLCQ-Orbitrap 进行代谢组学分析，通过Simca-p 筛查共发现651 种VIP 值大于1 的物质，经与数据库匹配确证发现，包括5 种化合物成分在有机和普通牛奶中在含量、数量上存在较大差异，例如有机泌乳早期奶中组氨酸含量高于普通奶的138 倍，有机泌乳晚期奶组氨酸含量高于普通奶的22 倍，这些化合物可作为有机奶和普通奶的差异性特征成分。另外含量较高的α-乳糖在普通奶中的含量是有机奶中1～2 倍，普通奶中肌酸含量是有机奶中的1～2 倍；胆碱在有机泌乳早期奶含量较高，是普通奶中的2 倍左右，异亮氨酸在有机奶中的含量是普通奶中的2～3 倍。因此该研究初步判定通过C 和N 同位素比值、这些差异性成分基本可区分内蒙乳企的有机奶和普通奶，该结论对有机奶和普通奶的差异化成分研究提供一定的科学依据。