嗜酸乳杆菌M6 提高小鼠运动能力和缓解疲劳功能的研究

付 明，臧延青

（1.黑龙江八一农垦大学体育教研部，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

运动性疲劳是指难以开始或维持自愿运动型活动，并可分为精神性运动疲劳和身体性运动疲劳，运动性疲劳会引起工作效率下降[1]，也是某些疾病的前兆，如癌症、多发性硬化症、抑郁症和帕金森病[2-4]。非病理性/生理性疲劳在不同运动过程、类型、强度和持续时间等生理上均有所表现[5-6]。在长时间的耐力锻炼中，肌肉所需的能量不足以维持和产生相同水平的力量，导致疲劳反应和降低运动表现[7]。由于现代社会的快速发展，疲劳已经成为越来越普遍的健康问题，而现代人偏向于用运动的方式解决健康问题的同时又会引发运动性疲劳。目前，对运动性疲劳有效治疗的药物或疗法在很大程度上仍无法满足需求[8-9]。研究发现，自由基的产生、能量的消耗和有害代谢产物的积累都会导致运动性疲劳[10]。近年来，运动营养补充剂被认为是提高运动表现或减少运动后疲劳的必要手段，对科学锻炼起到了重要作用。除了传统的草药、蛋白质和肌酸等，益生菌作为膳食补充剂受到越来越多的关注[11]。

益生菌是一种定植于肠道对宿主健康有益的活的微生物[12]。大量的研究表明，益生菌具有多种生物学效应，如提高胰岛素敏感性、诱导癌细胞凋亡、抗高血压、降胆固醇、抗炎、抗菌和抗氧化等[13-16]。近年来，越来越多的研究表明益生菌具有提高运动能力和抗疲劳的功能，因此越来越多地被运动员用作营养补充以提高运动表现和减少运动后疲劳[17]。在动物水平上，Yun 等[18]研究表明嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和嗜热链球菌可以延长小鼠力竭游泳时间。夏亚丽[19]研究表明混合益生菌可以改善大鼠疲劳相关指标。在人体水平，Callister 等[20]研究表明嗜酸乳杆菌具有缓解运动员疲劳的功能。Sullivan 等[21]研究表明嗜酸乳杆菌NCFB 1748、副干酪乳杆菌F19 和乳双歧杆菌Bb12 可以缓解慢性疲劳综合征患者疲劳程度。

本团队前期从长跑运动员粪便中分离出嗜酸乳杆菌M6，发现其具有良好的模拟胃肠液耐受性和黏附肠道的潜力。因此本研究首先通过检测小鼠肌肉力量和运动耐力评价嗜酸乳杆菌M6 改善小鼠运动能力的水平，随后检测疲劳相关指标、能量代谢相关指标、抗氧化相关指标，系统地评价嗜酸乳杆菌M6抗疲劳的作用，为开发提高运动表现和减少运动后疲劳的营养补充剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级雄 性C57BL/6N 小鼠 60 只，6 周龄，体质量18～21 g，北京维通利华实验动物技术有限公司[SYXK（京）2022-0052]；肌糖原试剂盒、肝糖原试剂盒、血糖试剂盒、甘油三酯试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 南京建成生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯 上海国药集团；嗜酸乳杆菌M6 分离自长跑运动员粪便 经过16S rDNA 系统发育分析鉴定，前期实验表明该菌株良好的模拟胃肠液耐受性和黏附肠道的潜力，该菌株保存在本实验室。

DHP-9272 型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LDZF-50KB-Ⅱ立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；TGL-16G 离心机 上海安亭科技仪器厂；DW-150W200 超低温冰箱 青岛海尔集团；HH-6D 单列数显恒温水浴锅 常州市凯航仪器有限公司；MF1035B 电子天平 济南童鑫生物科技有限公司；V-1600B 紫外可见分光光度计 青岛明博环保科技有限公司；GL-12MS/GL-12M 高速台式离心机赛默飞世尔科技（中国）有限公司；全波长酶标仪美国Bio-Rad 公司；Milli-Q 超纯水仪 美国Millipore公司；低力测试系统 日本爱光公司；自动分析仪美国Beckman 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌处理方法 将第3 代培养至18 h的嗜酸乳杆菌M6 从培养箱中取出，8000×g 离心10 min，弃去上清液后，再用无菌蒸馏水洗涤菌体3 次，之后将菌体重悬于无菌蒸馏水中，菌体浓度均调至1.5×1010CFU/mL，备用。

1.2.2 动物分组与饲养 将60 只6 周龄C57BL/6N雄性小鼠在明暗交替l2 h，室温为（22±2）℃，相对湿度为45%±5%的SPF 级动物房适应性饲养1 周，期间自由饮食和饮水，随机分为4 组：对照组、嗜酸乳杆菌M6 低、中、高剂量组，每组15 只。嗜酸乳杆菌M6 低、中、高剂量组每天分别灌胃0.2 mL 的3×107、3×108和3×109CFU 嗜酸乳杆菌M6，对照组灌胃等体积的蒸馏水，连续灌胃4 周。记录小鼠体重。本实验所涉及所有实验动物饲养均符合国家实验动物福利指南及实验动物伦理规范。

1.2.3 前肢握力检测实验 按照文献[22]描述，使用低力测试系统测量所有小鼠的前肢握力。

1.2.4 力竭游泳实验 末次灌胃30 min 后，小鼠尾根部进行负荷5%体质量的铅丝处理，放于40 cm 深度的游泳箱中游泳。实验过程确保小鼠四肢持续运动。小鼠力竭游泳时间为小鼠从游泳开始至鼻孔完全没入水中7 s，不能浮出水面的时间。

1.2.5 疲劳相关生化指标测定 末次灌胃后进行力竭游泳30 min，对所有小鼠进行无负重的游泳15 min，吹干，人道处死小鼠，取肝脏和前肢肌肉部位，洗净，吸干。在小鼠眼球取血，静置30 min 后，在4 ℃下1500×g 离心10 min 收集血清，血清中肌酸激酶活力、乳酸含量、尿素氮含量、氨含量用自动分析仪检测。

1.2.6 能量代谢相关生化指标测定 按照试剂盒说明书测定肝糖原、肌糖原、血糖和血清甘油三酯含量。

1.2.7 抗氧化相关指标的测定 血清SOD、CAT 和GSH-Px 的活力以及MDA 含量按照试剂盒检测方法检测。

1.3 数据处理

实验所有数据均平行测定3 次，数据结果以均值±标准偏差表示，采用SPSS 软件进行数值变量趋势性分析及Duncan' test 单因素分析，P＜0.05 为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠体重和肌肉力量的影响

通常情况下，需要有计划的运动训练才能增加握力[23]。如图1A 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6后，相比于对照组小鼠的体重增重，嗜酸乳杆菌M6低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的体重增重均无显著差异（P＞0.05）。如图1B 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6 后，相比于对照组小鼠的前肢握力，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的前肢握力均显著增加（P＜0.001），分别是124.01±6.02、132.02±4.30 和139.66±4.72 g；趋势分析显示随着嗜酸乳杆菌M6 剂量的增加，前肢握力呈剂量依赖性增加（P＜0.001），但中剂量组与高剂量组差异不显著。前期研究表明补充乳酸菌可降低肌肉萎缩标志物相关基因的表达水平[24]，乳酸菌可以减少作为腓肠肌和胫骨肌蛋白质分解的主要系统的自噬-溶酶体途径的标志物[25]。以上研究表明嗜酸乳杆菌M6 具有良好的增加肌肉力量的作用。

图1 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠体重增重（A）和前肢握力（B）的影响Fig.1 Effects of L.acidophilus M6 supplementation on body weight gain (A) and forelimb grip strength (B) in mice

2.2 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠运动耐力的影响

负重游泳实验可用于评估小鼠的运动耐力，且具有较高的重现性[26]。如图2 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6 后，相比于对照组小鼠，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的力竭游泳时间均显著增加（P＜0.001），分别增加0.55%、1.11%、2.07%；趋势分析显示随着嗜酸乳杆菌M6 剂量的增加，力竭游泳时间呈剂量依赖性增加（P＜0.001）。Yun 等[18]研究表明嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和嗜热链球菌可以延长小鼠力竭游泳时间约7 min。本研究显示在不通过训练的方式下，嗜酸乳杆菌M6 可以显著提高力竭游泳时间，以上研究表明嗜酸乳杆菌M6 具有良好的提高运动耐力的效果。

图2 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠力竭游泳时间的影响Fig.2 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on exhaustive swim time in mice

2.3 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠抗疲劳相关指标的影响

肌酸激酶是一种与能量转移、肌肉收缩和ATP再生直接相关的重要激酶。运动锻炼后，体内肌酸激酶显著增加，且与运动强度呈正相关[27]。如图3A 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6 后，相比于对照组小鼠，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血清肌酸激酶活力均显著（P＜0.001）降低，但中剂量组与高剂量组间无显著性差异。小鼠血清肌酸激酶活力分别降低16.00%、28.50%、33.90%；趋势分析显示随着嗜酸乳杆菌M6 剂量的增加，肌酸激酶活力呈剂量依赖性降低（P＜0.001）。夏亚丽[19]研究表明混合益生菌可以降低大鼠肌酸激酶的活力。这表明嗜酸乳杆菌M6 能够降低小鼠体内肌酸激酶活力，进而缓解机体疲劳。

图3 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠疲劳指标的影响Fig.3 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on fatigue-associated factors in mice

血液中的乳酸是机体发生糖代谢的必然产物，乳酸的升高将导致肌肉组织和血液的pH 下降，引发对人体功能有害的生化和生理过程，乳酸是评价机体有氧代谢和疲劳的重要指标[28]。如图3B 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6 后，相比于对照组小鼠，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血乳酸含量均显著（P＜0.001）降低，但中剂量组与高剂量组间无显著性差异，其乳酸含量分别是10.13±1.00、8.36±0.99 和6.09±0.36 mol/L；Huang 等[22]研究表明运动训练和长双歧杆菌OLP-01 联合可以显著降低乳酸含量，而本研究这表明嗜酸乳杆菌M6 单独使用能够降低小鼠血液中的乳酸，进而缓解机体疲劳。

在正常生理条件下，蛋白质和氨基酸等经过分解代谢产生氨，进一步通过肝脏产生尿素，最后经血液循环进入肾脏，随着尿液排出体外。由于疲劳时机体内糖含量无法满足运动供能的需求，因此机体内的蛋白质参与供能反应[29]。运动疲劳发生与血尿素氮含量的呈正相关[30]。如图3C 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6 后，相比于对照组小鼠的血尿素氮含量，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血尿素氮含量显著降低（P＜0.001），但三个剂量组间无显著性差异，分别降低13.40%、14.90%、31.50%；Lee 等[31]研究表明，1000 mg/kg 剂量的唾液酸乳杆菌SA-03 可以降低血尿素氮含量16.16%，低于本研究的效果（34.86%）。这表明嗜酸乳杆菌M6 能够降低小鼠血尿素氮，进而缓解机体疲劳。

氨是运动能量代谢过程中产生的一种重要代谢物，由不同来源产生。运动期间血液和大脑中积累的氨会对中枢神经系统产生负面影响，会导致疲劳。尽管运动引起的氨中毒是短暂和可逆的，具体取决于疾病状态，但它可能会影响中枢神经系统关键区域的持续协调活动。中枢神经系统在身体疲劳的发展中起着至关重要的作用[32]。如图3D 所示，补充4 周的嗜酸乳杆菌M6 后，相比于对照组小鼠的血氨水平，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血氨水平均显著（P＜0.001）减少，分别为115.34±4.50、99.67±4.50 和94.33±4.72 μmol/L，但中剂量组与高剂量组差异不显著；Lee 等[33]研究表明不同剂量的植物乳杆菌TWK10 均可以显著降低血氨水平，这表明嗜酸乳杆菌M6 能够降低小鼠血氨水平，进而缓解机体疲劳。

2.4 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠能量供给的影响

低血糖会抑制运动时大脑的活跃功能，导致无法继续运动[34]。如图4A 可以观察得到，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血糖浓度分别是3.26±0.25、4.00±0.20 和4.33±0.15 mmol/L，相比于对照组小鼠呈现出显著（P＜0.001）增加趋势，且血糖浓度随嗜酸乳杆菌M6 剂量的增加表现出剂量依赖性增加（P＜0.001），但中剂量组高剂量组之间差异不显著。综上，嗜酸乳杆菌M6 可以通过提高血糖浓度为机体提供能量。

图4 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠能量供给的影响Fig.4 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on energy supply in mice

肝糖原主要是在糖消耗后对其进行补充，使血糖稳定在正常水平。当处于疲劳状态下，在机体运动过程中首先消耗肌糖原，随后消耗肝糖原供能，因此，糖原消耗与疲劳程度紧密关联[35]。如图4B 显示出肝糖原含量与嗜酸乳杆菌M6 剂量成正比，与对照组小鼠的肝糖原含量相比均显著（P＜0.001）增加，但中剂量组与高剂量组差异不显著；在有氧运动中，肌糖原是中等强度运动时主要供能物质之一，因而肌糖原含量明显影响机体持续亚强度运动的时间。如图4C，肌糖原含量同肝糖原含量变化相似，含量分别是1.70±0.11、2.06±0.15 和2.46±0.30 mg/g。这表明嗜酸乳杆菌M6 可以通过提高肌糖原和肝糖原的积累为机体提供能量。

大部分能量以甘油三酯的形式储存在脂肪组织中。甘油三酯转化成游离脂肪酸，进入血液，就可以作为组织中的能量来源[36]。如图4D，相比于对照组，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血清甘油三酯含量均显著（P＜0.001）降低，数据显示分别为2.04±0.12、1.78±0.08 和1.55±0.04 mmol/L。这表明嗜酸乳杆菌M6 可以通过利用甘油三酯为机体提供能量。Zhang 等[37]研究表明发酵乳杆菌HFY03 可以显著提高运动后小鼠的能量供给水平，这与本研究较为一致。

2.5 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠氧化应激指标的影响

越来越多的证据表明，活性氧诱导蛋白质氧化，并强烈地促进肌肉疲劳[38]。益生菌可以减轻氧化应激，改善运动能力，降低疲劳程度[39]。因此本研究采用小鼠氧化应激指标评价嗜酸乳杆菌M6 的改善运动能力和缓解疲劳的作用。超氧化物歧化酶（SOD）是一种来源于活体的活性物质。它是一种含有金属元素的活性蛋白酶，能清除代谢过程中产生的有害物质，SOD 的含量可以直接反映机体的衰老疲劳程度[40]。如图5A 所示，相比于对照组小鼠的血清SOD 活力，嗜酸乳杆菌M6 低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的血清SOD 活力均显著（P＜0.001）增加，分别提高了6.82%、23.17%和37.80%；趋势分析显示随着嗜酸乳杆菌M6 剂量的增加，血清SOD 活力呈剂量依赖性增加（P＜0.001）。这表明嗜酸乳杆菌M6 可以通过提高SOD 活力，提高机体抗氧化能力，进而缓解疲劳。

图5 嗜酸乳杆菌M6 对小鼠氧化应激指标的影响Fig.5 Effect of L.acidophilus M6 supplementation on oxidative stress in mice

过氧化氢酶（CAT）可以将H2O2催化分解生成H2O 和O2，保护细胞膜结构和功能完整。因此，CAT常用来评价机体抗氧化能力。如图5B 所示，嗜酸乳杆菌M6 中剂量组和高剂量组小鼠的血清CAT 活力相较于对照组小鼠的血清CAT 活力均显著（P＜0.001）增加，分别提高了16.36%和35.15%。这表明嗜酸乳杆菌M6 可以通过提高CAT 活力，提高机体抗氧化能力，进而缓解疲劳。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是人体最重要的过氧化物酶之一，可用于评估疲劳和健康，能在体内将有毒的过氧化氢还原为无毒无害的羟基化合物，分解过氧化氢，保护细胞膜结构和功能的完整性[41]。运动使身体产生强烈的脂质氧化和葡萄糖代谢等氧化反应[42]。如图5C 所示，嗜酸乳杆菌M6 中剂量组和高剂量组小鼠的GSH-Px 活力随着嗜酸乳杆菌M6剂量的增加呈正比显著（P＜0.001）增加，分别提高了24.13%和38.96%。这表明嗜酸乳杆菌M6 可以通过提高GSH-Px 活力，提高机体抗氧化能力，进而缓解疲劳。

丙二醛（MDA）是机体内氧自由基的重要代谢物，反映机体潜在的抗氧化能力、脂质过氧化的速率以及组织过氧化损伤的程度[43]。运动缺氧可在心肌组织中产生大量自由基。自由基作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸，使膜脂发生过氧化作用，导致心肌细胞损伤，形成脂质过氧化，因此，在疲劳状态下，丙二醛浓度升高[40]。如图5D 所示，嗜酸乳杆菌M6 中剂量组和高剂量组小鼠的MDA 含量降低了14.71%和21.69%，其变化呈现反向增长。这表明嗜酸乳杆菌M6 可以降抑制体内脂质过氧化作用，进而发挥抗疲劳作用。Yi 等[44]研究表明植物乳杆菌CQPC02 可以缓解疲劳运动引起的氧化应激。Huang 等[45]报道植物乳杆菌PS128 可以改善高强度耐力训练引起的氧化应激，这与本研究结果相一致。

3 结论

本研究发现低、中、高剂量的嗜酸乳杆菌M6 均可以显著提高（P＜0.001）小鼠前肢握力和力竭游泳时间，低、中、高剂量的嗜酸乳杆菌M6 均可以显著（P＜0.001）降低小鼠肌酸激酶活力、乳酸、尿素氮和血氨等疲劳指标，增加血糖、肌糖原和肝糖原并降低甘油三酯含量等能量代谢指标，增加小鼠超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶酶活，并降低丙二醛含量，且存在剂量效应。因此，嗜酸乳杆菌M6具有改善小鼠运动能力和缓解运动后疲劳的作用。