新疆石河子市汉维两族学龄前儿童口腔菌群多样性

余重庆 沈玉凤 郑程东 陈铎 李东慧 钱艺 张若珍 马学花 周政

龋病系生物膜介导的、碳水化合物驱使的多因素动态疾病,导致牙体硬组织的周期性脱矿和再矿化[1]。第四次中国口腔健康流行病学报告指出:在中国,5岁儿童的牙齿患龋率为71.9%[2]。对于学龄前儿童(3～5 岁)而言,低龄儿童龋病(early childhood caries,ECC)是危害其健康的常见感染性疾病,世界卫生组织(WHO)将ECC列为重点防治疾病[3-5]。ECC的诱发因素较为复杂,多数学者支持四联因素学说:细菌、环境、宿主、时间是ECC发生发展的必要因素。其中,细菌作为最主要的因素。如何精准定位细菌是防治ECC的首要任务。

现阶段,随着分子分析方法的出现,使得探索细菌微生物多样性成为了可能,常用技术有聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、人口腔微生物鉴定芯片(HOMIM)以及16S rDNA高通量测序[6-8]。这些方法中,PCR-DGGE和HOMIM适用于分析微生物群落中的主要物种,而16S rDNA测序法则能够检测微生物组的全面概况[9]。在我国16S rDNA测序技术已广泛应用于食品科学,动物科学,环境科学等领域[10-12]。近年来,其在牙科微生物中的应用也越来越多,如牙周炎[13]、低龄儿童龋病[14]和根尖周疾病[15]。

新疆维吾尔自治区汉族和维吾尔族人口数量比例接近1∶1,在石河子市抽选的幼儿园学龄前儿童与该人口比例接近。因此本研究旨在采用16S rDNA测序的方法,探究汉族和维吾尔族有龋和无龋学龄前儿童口腔唾液中细菌菌群的多样性,为后续研究以及新疆不同民族学龄前儿童龋病的防治提供微生物学理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2021 年10～12 月对石河子市4所幼儿园的学龄前儿童进行口腔流行病学调查,经口腔检查后纳入3～5 岁的汉族和维吾尔族儿童一共54 例参与本研究。

1.1.1 受试者纳入标准 所有儿童在检查前1 个月内未服用抗生素,无系统性疾病、无先天性疾病或其他疾病(口腔黏膜疾病),口腔内未佩戴矫治器。本研究经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准(批准号:KJX-2021-084-01)。被检查的孩子都获得了家长或监护人允许并签署知情同意书。

1.1.2 口腔检查 3 名进行口腔医学临床相关工作的医生对符合纳入标准的儿童进行检查,并记录乳牙龋失补指数(dmft),检查器械均为一次性使用口腔器械。在检查前,所有医生均接受培训,检查医生之间Kappa值均>0.85。低龄儿童龋病的诊断标准采用的WHO《口腔健康调查基本方法》(第5版)。

1.1.3 具体分组 54 个样本被分为4 个组:(1)HCF组(汉族学龄前儿童无龋组,dmft=0)15 例;(2)HCA组(汉族学龄前儿童有龋组,dmft≥6)14 例;(3)WCF(维吾尔族学龄前儿童无龋组,dmft=0)13 例;(4)WCA(维吾尔族学龄前儿童有龋组,dmft≥6)12 例。

1.2 样本采集方法

采样前,根据已发表的文献[1]培训检查者。2021 年11～12 月上午10～12 点收集样本,受试者前一天晚上及当日早上不刷牙,采样前2 h内不进食并轻轻漱口。用5 mL无菌无酶冻存管收集参与者的未刺激唾液1.5 mL,置于-20 ℃的环境中转运,2 h以内运送到石大一附院口腔科-80 ℃冰箱内保存。

1.3 唾液细菌全基因提取、聚合酶链式反应(polymerace chain reaction,PCR)

选取符合条件的学龄前儿童唾液,儿童唾液中提取DNA按照PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories Inc.,CA)【Omega E.Z.N.A Stool DNA Kit(Omega Bio-tek Inc.,USA)】试剂盒说明书。提炼出的DNA通过Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific Inc.,USA)进行DNA质量和浓度检测。

在ABI 9700 PCR仪(ThermoFisher Scientific,Inc.)上进行扩增。

1.4 测序

使用NEB Next Ultra II DNA Library Prep Kit (New England Biolabs,Inc.,USA)建库试剂盒完成文库构建,通过Illumina Miseq PE300(Illumina,Inc.,USA)平台实现测序。

1.5 数据分析处理

以97%为一致性对序列进行操作分类单元(operational taxomomic units,OTUs)聚类分析,用Silva138数据库进行物种注释分析。通过聚类分析共获得1 350 个OTUs,注释到27 个门和357 个属。

计算α多样性,包括Shannon指数、Chao1指数、Observed species(OTU count)指数以及Phylogenetic(PD whole tree)指数。进行物种组成柱状图分析。计算β多样性,使用基于Bray-Curtis的主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)以及基于OTU的偏最小二乘法判别分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)。

2 结 果

2.1 测序信息

54 个样本被分为4 个组,所有样本通过Illumina平台测序后,一共有2 867 526 条优质序列来自54 个样本,平均每个样本有53 102 条序列。

4 个组所有样本包含1 350 个OTUs(operational taxonomic units):其中HCF和WCF组样本共有OTUs数975 个;HCA组和WCA组样本共有OTUs数800 个;HCF组和HCA组样本共有970 个OTUs;WCA和WCF组样本共有801 个OTUs。HCF组样本特有OTUs 55个;WCF组样本特有OTUs 17 个;HCA组样本特有OTUs 22 个;WCA组样本特有OTUs 70 个(图1)。

图1 不同分组儿童口腔菌群分布韦恩图

2.2 门水平上物种相对丰度

在门水平选取丰度排名最高的5 个物种,分别为硬壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形细菌门(Proteobacteria)、梭菌门(Fusobacteriota)、放线菌门(Actinobacteriota)等,生成物种丰度柱形图(图2)。HCA组与HCF组相比:拟杆菌门和梭菌门物种相对丰度较高,硬壁菌门和变形菌门物种相对丰度较低。WCA组与WCF组相比:硬壁菌门物种相对丰度较低,拟杆菌门物种相对丰度较高。HCF组与WCF组相比:硬壁菌门物种相对丰度较低而变形细菌门丰度较高。HCA组和WCA组相比:拟杆菌门相对丰度较高而变形细菌门丰度较低。

图2 门水平物种相对丰度柱形图

2.3 属水平上物种相对丰度

在属水平选取丰度排名最高的物种,生成物种丰度柱形图(图3)。HCA组和WCA组相比:普氏菌属(Prevotella),韦荣球菌属(Veillonella)和拟普氏菌属(Alloprevotella)相对丰度较高,链球菌属(Streptococcus)和奈瑟菌属(Neisseria)相对丰度较低。HCF组和WCF组相比:链球菌属相对丰度较低而奈瑟菌属相对丰度较高。HCA组和HCF组相比:普氏菌属、韦荣球菌属相对丰度较高,链球菌属相对丰度较低。WCA组和WCF组相比:普氏菌属及嗜血杆菌属(Haemophilus)相对丰度较高,链球菌属相对丰度较低。

图3 属水平物种相对丰度柱形图

2.4 唾液菌群α多样性分析

α多样性是群落生态学中微生物多样性分析,反映微生物群落的分布与差异[16]。

图4可见,HCF组的Chao1指数,PD whole tree指数,Observed species指数均高于WCA组(P<0.01);WCA组的Chao1指数和PD whole tree指数均低于WCF组(P<0.05)。HCA组与其他组相比α多样性指数有差异但不具有统计学意义(P>0.05)。

图4 唾液菌群α多样性分析

2.5 唾液菌群β多样性分析

β多样性是对不同样本间的微生物群落构成进行比较。

主坐标分析即PCoA分析,是一种用于研究样本群落组成的相似性或相异性的统计分析方法。不同分组样本由不同符号代表,样本之间距离越近说明他们之间的微生物群落结构越相似。由PCoA分析图可见WCF,WCA,HCF,HCA组唾液样本存在着明显的重叠,意味着不同分组学龄前儿童唾液中微生物组成相似(图5)。

图5 基于Bray-Curtis的主坐标分析图

PLS-DA是一种用于判别分析的多变量统计分析方法。由PLS-DA分析可以看出同一分组内有部分样本与其他分组重叠,另外一部分呈现出分散的趋势,意味着不同分组间部分儿童唾液中菌群结构存在相似性(图6)。

图6 基于OTU的PLS-DA图

3 讨 论

在新疆少数民族中,维吾尔族人口最多,人员分布最广。他们有着特殊的饮食习惯,生活环境和遗传学特征[17],对于汉维两族学龄前儿童而言,他们对于龋病的认知还没有完全形成,因此对其父母的健康宣教以及其他有效的干预措施是必要的。本研究中,通过16S rDNA基因测序的方法探索汉维两族有龋和无龋学龄前儿童口腔唾液内菌群分布差异。可以在微生物层面为两族学龄前儿童提供个性化预防。由韦恩图可以看出,不同民族有龋和无龋的学龄前儿童存在共有的OTUs和特有的的OTUs。

在门水平上,汉族患龋儿童和无龋儿童相比:拟杆菌门相对丰度较高,硬壁菌门、变形菌门相对丰度较低。维吾尔族患龋儿童和无龋儿童相比:硬壁菌门相对丰度较低,拟杆菌门相对丰度较高。在属水平上,汉族患龋儿童和无龋儿童相比:普氏菌属和韦荣球菌属相对丰度较高,链球菌属相对丰度较低。维吾尔族患龋儿童和无龋儿童相比:普氏菌属和嗜血杆菌属相对丰度较高,链球菌属相对丰度较低。因此在本研究中,对于同一民族儿童而言,患龋状态下口腔唾液内拟杆菌门丰度高于无龋状态而厚壁菌门丰度低于无龋状态。患龋儿童唾液中普氏菌属相对丰度较高而链球菌属相对丰度较低。此次研究结果发现儿童唾液中细菌物种相对丰度存在动态平衡,并未发现ECC特异性致病菌,即并未发现只存在于患龋儿童或无龋儿童口腔唾液中的细菌,这与之前的研究结果[18]一致。

根据唾液菌群α多样性分析,维吾尔族学龄前无龋儿童唾液样本中Chao1指数高于患龋儿童(P<0.05),表明其唾液中细菌群落丰富度较高,物种较丰富。同样人群唾液中的PD whole tree指数也高于患龋儿童(P<0.05),说明在本研究维吾尔族学龄前儿童中,与患龋儿童相比,无龋儿童唾液中菌群多样性更高。对于汉族无龋儿童而言,无龋儿童的Chao1指数,PD whole tree指数,Observed species指数以及Shannon指数均高于对应的患龋儿童,但其差异均不具有统计学意义(P>0.05),表明无论汉族学龄前儿童是否患龋,其口腔唾液中菌群物种多样性及丰富度均无明显差异。与Jiang等[9]的研究结果一致。根据唾液菌群β多样性分析,PCoA分析和PLS-DA分析均表明在不同分组中,学龄前儿童的唾液菌群仍然存在着一定的相似性,意味着不论是不同民族还是患龋或无龋状态,学龄前儿童唾液中的菌群结构都会有所重叠。这与之前的研究结果一致[14]。后续的研究可以从患龋儿童龋洞中收集样本,从而更加深入地探讨龋病与口腔内微生物之间的关系。

Gomez等[19]的研究发现口腔微生物结构易受宿主基因、饮食影响。而汉族和维吾尔族在饮食结构,生活习惯和遗传学上有着显著差异,后续的研究应该着重于不同饮食结构、不同生活环境以及基因层面上的研究。人类口腔内微生物在人体健康中扮演着重要角色[20-22],本研究中的结果说明龋病的发生发展并非是预期的出现某种特异性致病菌的简单过程。事实上,人口腔中微生物和宿主相互协调,达到一个“共生”的状态,一旦平衡被打破,口腔微生物群落失衡,会引起一系列口腔疾病甚至波及全身[23-24]。

值得关注的是,本次研究结果发现维吾尔族学龄前儿童有龋组普氏菌属物种相对丰度高于无龋组,Qudeimat等[25]也发现其在患龋组学龄前儿童中占据显著地位,与本研究结果一致,但目前还没有针对普氏菌属和低龄儿童龋病的纵向研究。因此,普氏菌属可以作为下一步研究的重点菌群。本课题组也将对此次纳入的研究对象进行定期的随访,时间周期为3个月,旨在探索普氏菌属在汉族和维吾尔族学龄前儿童龋齿发病进展中的详细作用。

综上所述,本研究对于不同民族有龋和无龋学龄前儿童口腔唾液中菌群多样性进行了初步探索,确认了维吾尔族学龄前儿童在龋病发生发展过程中唾液内菌群多样性减少,为新疆维吾尔族儿童龋病相关的防治在微生物层面提供了参考,对于汉族学龄前儿童,由于本研究纳入的样本量不够大,结合汉族儿童复杂的饮食结构、生长环境以及遗传学特点,尚不能确认汉族学龄前儿童在龋齿发病过程中唾液内菌群变化情况。还需要采取更尖端的技术,更庞大样本数量来探索不同民族学龄前儿童口腔唾液中微生物群落的变化。