基于HS-SPME-GC-MS建立广陈皮陈化年份快速判别模型

石洪超， 陈明权， 商雪莹， 李华， 孙东， 覃仁安， 何风雷

（1.广州白云山陈李济药厂有限公司，广东广州 510288；2.广东省药品检验所，广东广州 510663）

广陈皮为经典的药食同源产品，其中来源于茶枝柑，Citrus reticulata‘Chachi’的果皮称为“广陈皮”，为道地药材，主产于两广地区。传统中医药理论及历代本草论述中均认为广陈皮“陈久者良”，是指广陈皮需放置陈化后才能作为药用，且陈化时间越久，药效越好[1]。在广陈皮的市场流通过程中，陈化年份对广陈皮的价格也具有决定性的影响，从而产生了“一两陈皮一两金，百年陈皮胜黄金”的说法。但对于广陈皮年份的判定，并没有相关的统一标准及规定，基本靠陈皮销售者自律和采购者的经验鉴别，为维护陈皮市场健康稳定的发展，建立广陈皮年份准确、快速的判定方法在陈皮市场行业中尤为重要。

广陈皮在陈化过程中会出现外观颜色差异与气味差异，也是经验判别广陈皮陈化年份的重要参考。外观颜色易受到干燥方式、储存条件、加工炮制方法等因素的影响而发生改变[2-3]，而气味差异预示着不同陈化年份广陈皮中的挥发油成分处于动态变化之中。相对而言，内在的成分指标更为稳定，因此，从挥发油成分的角度探索广陈皮随陈化年份的变化规律是可行的、合理的。目前，针对不同陈化年份广陈皮的挥发油变化已有诸多研究[4-5]，但对于挥发油成分变化趋势及与年份间的内在规律未能阐述清楚，难以准确地鉴别广陈皮年份。因此，本研究以自然陈化的广陈皮为研究对象，探寻挥发油成分与陈化年份之间的规律，以期建立一种广陈皮陈化年份的鉴别模型，既可真实、客观地反映不同年份广陈皮之间气味差异的成分变化，又可快速、准确地鉴别出广陈皮的陈化年份，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1 试验样品为保证用于建立模型的样品陈化年份的可靠性，本试验样品直接从在广陈皮道地产区且建立广陈皮规范化产业化种植基地的公司购买，其中编号为CP1 ～CP6 购自江门市新会区柑满园食品有限公司（种植基地位置为22°23’25”N、113°7’20”E），CP7 ～CP10 购自江门市蓬江区高品农业发展有限公司（种植基地位置为22°19’59”N、113°6’42”E）。本研究所用样品均由广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定为芸香科植物茶枝柑，Citrus reticulate‘Chachi’的果皮，样品详细信息见表1。

表1 广陈皮样品信息表Table 1 Sample information sheet of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

1. 2 仪器7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；75 μm PDMS/DVB 固相微萃取仪-纤维头（美国SUPELCO 公司，灰色）；BS110S型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；WXJ 型粉碎机（上海凯旋中药机械制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品制备将广陈皮样品剪碎成边长1 cm的小方块，取1.0 g 于250 mL 顶空瓶中，密封后于90 ℃水浴平衡10 min，插入固相萃取纤维50/30 μm CAR/DVB/PDMS顶空萃取40 min，250 ℃解吸3 min进样。

2.2 测定条件色谱条件：采用安捷伦HP-5 MS（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）色谱柱，高纯He 作为载气，流速为1.0 mL/min，进样口温度为230 ℃，采用程序升温模式，柱初始温度为50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升至70 ℃，保持10 min；以8 ℃/min的速率升至110 ℃，保持5 min；以4 ℃/min的速率升至210 ℃，保持2 min。分流比为30∶1。质谱（MS）条件：离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，离子采集范围35 ～450，m/，z。广陈皮样品GC/MS色谱图，见图1。

2.3 挥发油测定结果所得质谱数据与NIST14数据库进行匹配后，将每组数据进行整理，选择其中每个峰的高匹配成分（定性匹配度＞80）。10 组（8个不同陈化年份）广陈皮共匹配出75个挥发油成分，其中共同含有的挥发性成分有17 个，编号为S1 ～S17，见表2。各成分在不同陈化年份的广陈皮中相对含量存在明显差异，且与陈化年份呈现上升、下降或先上升再下降等多种变化趋势。

表2 不同陈化年份的广陈皮中共有挥发性成分Table 2 Total volatile components in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years

2. 4 挥发油成分随储存广陈皮年份变化规律分析为探寻共有成分与不同陈化年份之间的相关性，采用SPSS 19.0 软件对17 个共有成分分别与陈化年份进行Pearson 相关性分析，其中有8 个成分与陈化年份具有一定的相关性，见表3。成分S9、S16、S17 与年份具有非常显著相关性（P＜0.01），S6、S7、S8 与陈化年份具有显著相关性（P≤0.05），成分S4、S15 虽然与年份的相关性不显著（P＞0.05），但考虑到其Pearson 相关系数绝对值均大于0.7，也认为成分S4、S15 与陈化年份之间具有一定的相关性。由表2 可看出：成分S4、S6、S7、S8、S15 整体上呈现出随着陈化年份增加，其相对含量逐渐减少的趋势；而成分S9、S16、S17 则呈现随着陈化年份增加，其相对含量也逐渐增加的趋势。因此，拟将上述8个共有成分纳入与年份变化规律的研究范畴。

表3 不同陈化年份广陈皮中的8个共有成分与陈化年份之间的相关性分析结果Table 3 Correlation analysis results between 8 common components in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years and aging years

将与年份呈负相关的成分（S4、S6、S7、S8、S15）分别排列组合作为分子组，与年份呈正相关的成分（S9、S16、S17）分别排列组合作为分母组，将每个分子组分（FZ）和分母组分（FM）分别进行比较，为顾及成分组合的完整性和包容性，分子组与分母组均尽量包含2个及以上的成分，并结合筛选条件（①优选分子与分母中含数量较多的成分，②成分与年份的相关性，P＜0.01 或其相对含量＞0.05%），筛选出与年份呈连续下降或上升趋势的比值，见表4。最终选定“S9+S16”成分组合作为分母，“S4+S6+S7+S8”与“S4+S6+S7+S8+S15”成分组合作为分子，2 组比值均与年份呈连续下降的趋势，结果见表5。

表4 广陈皮中与年份呈连续变化趋势的组合汇总Table 4 Summary of combinations with continuous trend with year in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表5 广陈皮中与年份呈连续变化趋势的组合比值Table 5 Ratio of combinations with continuous trend with year in Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

2.5 建立陈化年份判别模型以陈化年份作为自变量（X），以2 组比值分别作为因变量（Y），采用SPSS 19.0 软件对上述2 组比值分别采用11 种模型进行曲线模拟，上述2组比值分别作为因变量在进行曲线模拟后，发现比值（S4+S6+S7+S8）/（S9+S16）的各模型方程在整体上相关系数R2 高，说明本成分组比值可以更好地反映陈化年份变化规律的真实情况，结果见表6。

表6 2组比值因变量的模型相关系数Table 6 Model correlation coefficients for 2 sets of ratio dependent variables

陈化年份作为自变量（X），以比值（S4+S6+S7+S8）/（S9+S16）分别作为因变量（Y），进行曲线模拟，在所有的曲线模拟模型中，优先选择模型相关系数（R2）最高的曲线；由表7、表8 可知，“复合”“增长”“指数”以及“Logistic”模型相关系数最高且一致（R2= 0.949），且4 种模型相应的模拟曲线图完全一致，见图2。因此，4 个方程表达式实为同一函数，综合考虑到上述4 种方程在实际应用中的运算复杂性，最终选择复合方程，Y= 613.555×0.893，X（R2=0.949）作为判别不同陈化年份的广陈皮的模型。

图2 4种广陈皮陈化年份判别模型方程拟合曲线图Figure 2 Fitting curves of the model equations for determining the ageing years of 4 types of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表7 广陈皮陈化年份判别模型汇总和参数估计值Table 7 Summary and parameter estimates of the model for determining the ageing year of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

表8 4种广陈皮陈化年份判别模型方程表达式Table 8 Expression of the model equation for determining the ageing year of 4 kinds of Guangdong Citri Reticulatae Pericarpium

3 讨论

对于自然陈化的广陈皮，可以通过人体嗅觉发现3、10、20、30年等年份跨度较大的广陈皮气味依次为果香味、清香扑鼻、陈香醇厚及药香陈味，这意味着不同年份广陈皮在陈化过程中出现动态变化的挥发油成分涉及多个成分（4 个及以上），而非单一成分。

现代研究表明，广陈皮挥发油变化规律较为复杂，随着陈化年份的增加，挥发油的总量变化有不同的研究结论[6-7]，归结于影响陈皮挥发油的因素有很多，包括广陈皮自身采摘期、储存条件以及挥发油的提取方式等。因此，在探索不同陈化年份的广陈皮挥发油变化规律过程中，试验样品的选择及挥发油的提取方式尤为重要。

关于试验样品的选择方面，根据地方标准《DB4407/T70-2021 地理标志产品新会陈皮》中规定的“广陈皮”需在自然陈化环境下保存时间3年或以上[8]。另有研究显示，陈化年份大于5 年的广陈皮具有特定波段的吸收[9]，且挥发性成分的含量趋于稳定[10]。因此，本研究以自然陈化5 年以上的广陈皮为研究对象，探寻其挥发油成分与陈化年份之间的规律。在挥发油提取方式的选择上，本研究采用SPME 技术提取陈皮样品中挥发油成分，与传统的挥发油提取技术不同的是，SPME 技术既不会破坏陈皮样品又能使挥发油成分被充分提取，节省提取时间，操作便捷，符合快速检验的目的。

本研究对参与模型拟定的挥发油成分，不仅要求成分与年份具有一定的相关性，而且为了能综合全面地反映挥发性成分的动态变化，分子与分母成分组中包含的挥发油成分数量均在2个及以上，且规定各组合的相对含量以及各组合之间产生的比值均与年份呈连续下降或上升的趋势，相较于其他研究[11]中单一的分子与分母的组合，本法更能真实地反映出挥发油与年份的变化规律。最后进行函数拟合所得到的模型相关系数，R2为0.949，表明本法拟合的方程模型判别广陈皮年份的准确率更高。以本拟合函数作为广陈皮陈化年份的判别模型是可行的、准确的。但本年份判别模型是否适用于陈化5 年以下、33 年以上的广陈皮，尚有待于相应陈化年份的陈皮样品作进一步验证。