宣肺开闭汤通过抑制TGF-β1/Smad3通路减缓小鼠肺纤维化进展

孔维祎， 郝欧美， 盛秋菊

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳 110032）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种慢性间质性肺疾病，其主要特征为肺成纤维细胞异常增殖、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度积累及组织结构破坏等，最终导致肺瘢痕形成、肺功能不全和呼吸衰竭[1-2]。目前，临床常用治疗肺纤维化的药物以激素、免疫抑制剂及细胞毒性药物为主，但由于明显的毒副作用导致其治疗效果并不理想[3]。肺移植也是肺纤维化治疗的有效方法，但由于肺配体稀缺且移植费用高昂，使其在临床上的应用受到一定的限制。而中医药对防治肺纤维化具有一定的优势，且能有效改善患者生活质量[4]。中医学将肺纤维化归属于“肺痿”“肺痹”“肺胀”等范畴，认为其发病机制为气虚血瘀，痰热互结，痹阻肺络[5]。本课题组前期应用宣肺开闭汤治疗各种肺炎患者，发现其可明显延缓患者肺纤维化的发生，但其抗肺纤维化机制尚不明确。近年来，有大量相关研究证实，转化生长因子β1（TGF-β1）/Smads 信号通路与器官纤维化的发生密切相关，其中，TGF-β1 是导致纤维化的关键介质，可介导细胞的多种生物学活性，包括生长、分化、迁移、凋亡等，并能激活Smads信号通路，促进促纤维化因子的过度表达[6-7]。目前，关于调控TGF-β1/Samds 信号通路对肺纤维化的防治受到学者们的广泛关注。因此，本研究构建博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型，观察宣肺开闭汤对肺纤维化小鼠TGF-β1/Samds 信号通路的影响，探讨宣肺开闭汤抗肺纤维化的作用机制，以期为临床应用宣肺开闭汤治疗肺纤维化提供基础数据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1. 1 实验动物60 只6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠，体质量18 ～20 g，均购自长春亿斯实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（吉）2018-0007。实验单位为辽宁中医药大学，实验动物使用许可证号：SYXK（辽）2019-0004，饲养环境：20 ～25 ℃，相对湿度55%～65%，光照12 h/黑暗12 h 交替，普通饲料喂养，自由饮食摄水。动物实验方案已获得辽宁中医药大学动物伦理审批委员会审批通过，审批号：AEWC-211606。

1. 2 试剂与仪器博来霉素（天津太和制药有限公司生产，批号：国药准字H20055883）；TGF-β1/Smads 通路激活剂SRI-011381 hydrochloride（北京百奥莱博科技有限公司，批号：53562ES08）；小鼠抗TGF-β1 单克隆抗体、小鼠抗Smad3 抗体（美国Abcam 公司）；羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量测定试剂盒（南京建成悦浩科技有限公司）；兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（美国Sigma公司）。T100 PCR 仪（伯乐生命医学产品有限公司）；HBS-1101 酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；CX41-12C02倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1. 3 药物宣肺开闭汤由杏仁、桑白皮、鱼腥草、僵蚕、白花蛇舌草、芦根、太子参、贝母、麦冬、生石膏、沙参各10 g，桔梗、黄芩、枇杷叶、蝉衣、丹参各8 g 等组成，其组方中药材均购自北京同仁堂连锁药店有限公司。制备：先将以上中药材加水浸泡30 min，后加水稍没过中药为度，武火煎煮至沸腾，后转至文火维持60 min，倒出药液后同上述方法再次加水煎煮，将两次煎煮的药液混合并浓缩至不同生药含量，即2、4、8 g/mL，保存于-20 ℃冰箱待用。

1.4 分组、模型制备与给药将60只小鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组，模型组，宣肺开闭汤低、中、高剂量组及宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381 组，每组各10 只。除空白组外，其余各组小鼠均构建肺纤维化模型[8]。方法：应用2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉满意后，固定小鼠于解剖台，颈部剃毛消毒，沿正中线切开并暴露气管，将5 mg/L 博来霉素生理盐水溶液经气管注入，剂量为0.3 mL，注入后翻转小鼠，使药物在肺部均匀分布。空白组小鼠仅注射等体积的生理盐水干预。后将各组小鼠分笼饲养。模型制备成功标准：小鼠活动力降低，且出现挠鼻、咳嗽等呼吸道症状。

造模成功后，根据文献研究[9]，宣肺开闭汤低、中、高剂量组小鼠分别给予灌胃200、400、800 mg·kg-1·d-1的宣肺开闭汤；宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381 组给予灌胃800 mg·kg-1·d-1的宣肺开闭汤后，腹腔注射TGF-β1/Smads 通路激活剂SRI-011381 hydrochloride10 mg·kg-1·d-1干预；空白组和模型组给予灌胃等积体的生理盐水。每日1 次，连续给药28 d。

1.5 观察指标与方法

1. 5. 1 HE 染色法观察肺组织病理变化及炎症评分 给药结束后，断头法处死各组小鼠，消毒开胸，取小鼠肺组织并固定于4%多聚甲醛溶液中，制作石蜡切片。常规脱蜡至水，将组织切片浸泡于去离子水中，加入苏木素染色1 min，冲洗干净后加入伊红染色，30 s后取出组织切片脱水透明，封片后置于显微镜下观察。参照Wzapiel 法[8]评估小鼠肺泡腔炎症程度，评分标准见表1。

表1 肺泡腔炎症程度评分标准Table 1 Scoring of the degree of alveolar inflammation

1.5.2 Masson 染色法观察肺组织纤维化及纤维化程度评估 将肺组织切片常规脱蜡至水，加入苏木素染色5 min，PBS 冲洗后加入Masson 蓝化液返蓝，3 min 后冲洗干净，再加入品红染液染色5 min，后用1%磷钼酸水溶液处理切片1 min。将切片浸于苯胺蓝夜或绿液复染2 min，0.2%冰醋酸处理1 min，90%乙醇脱水后透明，中性树胶封片，于显微镜下观察。参照Wzapiel 法[8]评估小鼠肺间质纤维化程度：无肺间质纤维化计为0分；轻度肺间质纤维化，病变面积小于20%时计为1 分；中度肺间质纤维化，病变面积为20%～50%时计为2 分；重度肺间质纤维化，病变面积大于50%时计为3分。

1. 5. 3 免疫组织化学法测定肺组织中α-SMA

表达 肺组织切片常规脱蜡至水，用抗原修复切片，后在切片中加入山羊血清封闭。加入一抗α-SMA 抗体（1∶400），再加入生物素化山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），DAB显色，苏木素复染，经脱水透明后封片。应用图像分析软件系统，每张切片随机选取染色区域6个高倍视野，测定其吸光度（OD）值。

1. 5. 4 ELISA 法测定肺组织Hyp 含量 取各组小鼠左肺下叶组织0.8 ～1 g，按照1∶9 的比例加入生理盐水进行匀浆，在4 ℃环境下，以离心机3 000 r/min（离心半径15 cm）离心10 min，收集上清液。采用Hyp ELISA 试剂盒测定肺组织均浆液中Hyp 的含量，应用酶标仪于550 nm 波长处测定OD值。

1.5.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测肺组织中TGF-β1、Smad3 蛋白表达 取小鼠肺组织，提取总蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法检测总蛋白浓度。将蛋白溶液的终浓度配制为2 μg/mL，置于热水中煮沸10 min后，保存在-20 ℃冰箱中。取30 μg的蛋白样品进行电泳（200 V 电压），转移蛋白样品至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉封闭PVDF 膜1 h，将一抗TGF-β1、Smad3（1∶1 000）加入到PVDF膜上，4 ℃孵育过夜，冲洗PVDF 膜后，加入二抗（1∶1 000），室温孵育2 h。洗膜后，加入ECL 液，曝光显影后用Image Lab 软件分析条带灰度值。以β-actin为内参。

1. 5. 6 实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肺组织中TGF-β1、Smad3 mRNA 表达 取小鼠肺组织研磨，匀浆，加入TRIzol 裂解液裂解，提取总RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行。逆转录总RNA为cDNA，操作步骤按照试剂盒说明书操作。TGF-β1 引物序列，上游：5’-GTTCCTGCCA TTCTGGTGCA-3’，下游：5’-TGCGTGTCAGGGG TTGGTTAC-3’，扩增片段长度293 bp；Smad3 序列，上游：5’-CTACCGACTGCGAGGCATAA-3’，下游：5’-CGAGCCGATACATCGATCCT-3’，引物扩增片段长度530 bp；GAPDH（内参）引物序列，上游：5’-CAGATGCTCGCAAGGTAGGA-3’，下游：5’-ACAGAAGTAGTACGCAGACTG-3’，扩增片段长度469 bp。PCR 反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共计40个循环。用2-△△CT法分析目的基因相对表达量。

1.6 统计方法采用Graphpad priam 8.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数± 标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，各组间两两比较采用LSD-，t检验，以，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组小鼠肺组织病理学变化及炎症评分比较图1 结果显示：空白组小鼠肺组织结构正常，无间隔水肿，肺泡可见少量的炎性细胞浸润，肺泡腔炎症评分显著高于空白组（P＜0.05）；模型组小鼠肺泡间隔增厚，肺泡结构破坏连成大片状实变，实变区内可见大量的炎性细胞浸润，肺泡腔炎症评分显著高于空白组（P＜0.05）；宣肺开闭汤低、中、高剂量组小鼠肺组织结构较模型组明显改善，肺泡间隔增厚程度明显减轻，炎性细胞浸润也明显减少，肺泡腔炎症评分显著低于模型组（P＜0.05），且各剂量组作用效果呈剂量依赖性；宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381组小鼠肺组织病理学表现与模型组相似，肺泡腔炎症评分较宣肺开闭汤高剂量组明显增加（P＜0.05）。

图1 各组小鼠肺组织病理学变化及炎症评分比较Figure 1 Comparison of lung tissue pathological changes and inflammation scores among each group of mice

2.2 各组小鼠肺组织纤维化情况及评分比较图2结果显示：空白组可见极少量的蓝色胶原纤维沉积于肺泡间隔及肺血管壁；模型组可见典型的肺间质纤维化变化，肺泡间隔及肺血管壁可见片状或束状胶原纤维沉积，大量蓝染胶原沉积于肺腔内，肺纤维化程度评分显著高于空白组（P＜0.05）；宣肺开闭汤低、中、高剂量组蓝色纤维主要表达于支气管壁、肺血管壁的肌层下，肺纤维化程度评分显著低于模型组（P＜0.05），且呈剂量依赖性；与宣肺开闭汤高剂量组比较，宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381组肺纤维化程度评分显著升高（P＜0.05），肺组织纤维化程度与模型组相似。

图2 各组小鼠肺组织纤维化情况及评分比较Figure 2 Comparison of lung tissue fibrosis and scores among each group of mice

2. 3 各组小鼠肺组织中α-SMA 表达比较图3结果显示：与空白组比较，模型组小鼠肺组织中可见大量的α-SMA 棕黄色阳性染色细胞聚集成团，α-SMA OD 值升高（P＜0.05）；与模型组比较，宣肺开闭汤低、中、高剂量组阳性染色细胞数量减少，α-SMA OD 值降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性；与宣肺开闭汤高剂量组比较，宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381 组小鼠肺组织中可见α-SMA 棕黄色阳性染色细胞数量明显增加，α-SMA OD值升高（P＜0.05）。

2. 4 各组小鼠肺组织中Hyp 含量比较图4 结果显示：与空白组比较，模型组小鼠肺组织中Hyp含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，宣肺开闭汤低、中、高剂量组小鼠肺组织中Hyp 含量均显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性；与宣肺开闭汤高剂量组比较，宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381 组小鼠肺组织中Hyp 含量显著增加（P＜0.05）。

2.5 各组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3的蛋白表达比较图5结果显示：模型组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3 的蛋白表达水平均高于空白组（P＜0.05）；宣肺开闭汤低、中、高剂量组小鼠肺组织TGF-β1、Smad3 的蛋白表达水平均低于模型组（P＜0.05）；与宣肺开闭汤高剂量组比较，宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381 组小鼠肺组中TGF-β1、Smad3 的蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）。

图5 各组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3的蛋白表达比较Figure 5 Comparison of protein expressions of TGF-β1 and Smad3 in lung tissue among each group of mice

2.6 各组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3 的mRNA

表达比较图6结果显示：与空白组比较，模型组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3 的mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05）；宣肺开闭汤低、中、高剂量组小鼠肺组织TGF-β1、Smad3 的mRNA 表达水平均明显低于模型组（P＜0.05），且呈剂量依赖性；与宣肺开闭汤高剂量组比较，宣肺开闭汤高剂量+SRI-011381 组小鼠肺组中TGF-β1、Smad3的mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）。

图6 各组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3的mRNA表达比较Figure 6 Comparison of mRNA expressions of TGF-β1 and Smad3 in lung tissue among each group of mice

3 讨论

近年来，肺纤维化的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，且新冠肺炎重症患者以肺纤维化为主要特征，由于肺纤维化不易逆转，对患者的生命造成了严重的威胁，因此，寻找和开发治疗肺纤维化新的有效药物尤为重要[10]。肺纤维化临床证候错综复杂，患者在临床上通常表现为呼吸潜短且不相顺接，随着肺纤维化程度的加重，患者逐渐会出现瘀血阻滞、肺络不通的表现[11]。本研究应用的宣肺开闭汤中：杏仁、桑白皮、贝母、枇杷叶，清热润肺，化痰止咳；太子参、麦冬、沙参、芦根益气健脾生津，加强润肺功效；鱼腥草、白花蛇舌草、黄芩、生石膏，清热解毒，加强退热功能；蝉衣、僵蚕为虫药，疏风止咳、祛风通络；桔梗，宣肺，利咽，祛痰，排脓；丹参，活血化瘀，凉血消痈。全方共奏宣肺开闭、清肺通络功效，符合肺纤维化中医病机特点。

本研究采用气管灌注博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型，结果发现，肺纤维化模型组小鼠肺组织出现明显的肺泡炎症及纤维化等改变。羟脯氨酸（Hyp）是机体胶原纤维特有的氨基酸之一，其在肺组织中的含量可评定肺间质纤维化程度，目前已被临床广泛应用[12]。本研究通过检测肺组织匀浆中Hyp 含量发现，模型组小鼠Hyp 含量明显增加。给予不同剂量的宣肺开闭汤后发现，Hyp含量明显降低，肺组织纤维化、炎症程度明显减轻，且随着宣肺开闭汤剂量的增加效果更显著，表明宣肺开闭汤可有效改善小鼠肺纤维化。

成纤维细胞灶主要由肌成纤维细胞（MFb）构成，是继发性肺纤维化的主要病理学特征之一[13]。MFb 是造成细胞外基质（ECM）异常沉积的主要效应细胞[14]。研究[15]表明，MFb 可抑制成纤维细胞的增殖和分化，进而对肺纤维化程度发挥减缓作用。α-SMA 是成纤维细胞向MFb 转化的标志性蛋白，其蛋白表达水平可间接反映MFb 的增殖情况[16]。本研究结果显示，模型组小鼠肺组织中α-SMA表达明显升高，不同剂量的宣肺开闭汤干预后，小鼠肺组织中α-SMA 表达明显降低，提示宣肺开闭汤可阻止肺组织中α-SMA 表达，进而通过抑制MFb的增殖来抑制肺纤维化的发展。

有研究[17]表明，TGF-β可调控肺成纤维细胞中α-SMA 的表达。TGF-β1作为一种致纤维化因子可介导肺纤维化的发生，其是通过诱导ECM 过度沉积，并对成纤维细胞过度增殖和分化起促进作用所致[18]。Smad蛋白是TGF-β1诱导纤维化作用的关键效应分子之一，当TGF-β1结合其受体后，磷酸化Smad2、Smad3、Smad4 后，形成复合物转移到细胞核，进而启动TGF-β1靶基因的转录。侯欢等[19]研究发现，Smad3 抑制剂可通过抑制Smad3 的磷酸化减少TGF-β1处理的人真皮成纤维细胞的肌成纤维细胞分化和胶原合成；还有研究[20]发现，TGF-β1/Smad3 信号通路可介导纤维化、凋亡和炎症反应，抑制纤维化疾病中TGF-β1/Smad3 信号通路的活性，对治疗疾病有重要作用。本研究结果显示，模型组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3 的蛋白及mRNA 表达明显升高，宣肺开闭汤干预后，各剂量组小鼠肺组织中TGF-β1、Smad3 的蛋白及mRNA表达均明显降低，提示宣肺开闭汤可能通过抑制TGF-β1/Smad3 信号通路抑制小鼠肺纤维化进程。为了验证该结果，本研究采用TGF-β1/Smad3信号通路激活剂SRI-011381 hydrochloride 和高剂量的宣肺开闭汤联合干预肺纤维化小鼠，结果显示SRI-011381 hydrochloride 能减弱宣肺开闭汤对小鼠肺纤维化进程的抑制作用。

综上所述，宣肺开闭汤可抑制博来霉素诱导小鼠肺纤维化的进程，其作用机制与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。