基于PI3K/Akt/AS160/GLUT4通路探讨芪丹颗粒改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用机制

吴俊伟， 张越， 黄宝怡， 陈敏静， 陈冬妮， 尹桃清， 叶仁群

（1.深圳市宝安区中医院，广东深圳 518000；2.东莞松山湖高新技术产业开发区社区卫生服务中心，广东东莞 523000）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种常见的代谢性疾病，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是其主要发病机制[1]。胰岛素利用葡萄糖的效率减弱，导致机体代偿性分泌过多的胰岛素，从而引发高胰岛素血症和胰岛素抵抗。靶组织在正常胰岛素水平下无法正常地抑制内源性葡萄糖生成或抑制脂肪分解，这迫使机体增加胰岛素的分泌，同时降低了机体对胰岛素的反应性。胰岛素受体底物1（IRS-1）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途径是经典的胰岛素信号传导通路，激活这一途径能够促进胰岛素信号的传导，增加胰岛素敏感性[2]，磷酸化Akt可影响其下游蛋白葡萄糖转运体4（GLUT4）的表达和膜转位，抑制细胞内葡萄糖向细胞外转运，从而降低血糖[3]。因 此，以PI3K/Akt/160 kDa 的Akt 底 物（AS160）/GLUT4 信号通路为切入点，探讨其在T2DM 胰岛素抵抗治疗中的作用具有重要的研究意义。

芪丹颗粒是在长期临床实践中通过总结消渴病基于“阴虚为本，燥热为标”的病因病机并根据患者治疗效果组成的经验方，现为广东省深圳市宝安区中医院院内协定处方。本课题组前期应用芪丹颗粒治疗T2DM 胰岛素抵抗患者，取得了显著的临床疗效[4-5]，但其具体机制尚不明确。因此，本研究通过建立T2DM 大鼠胰岛素抵抗模型，探讨芪丹颗粒是否能通过调节PI3K/Akt/AS160/GLUT4信号通路改善胰岛素抵抗，以期为芪丹颗粒临床治疗T2DM 提供理论和实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物60只SPF级健康3周龄雄性Wistar大鼠，体质量（100 ± 20）g，购自斯贝福（北京）生物科技有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010]，于广州中医药大学（华南针灸研究中心）[实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2017-0179]内饲养，饲养条件：环境温度20 ～24 ℃，相对湿度40%～60%，使用独立供气动物笼系统，每天定时换气，保持昼夜交替明暗时间各12 h，食水不限。本动物实验方案已通过广州中医药大学实验动物伦理委员会审批通过， 伦理批号：20221227002。

1. 2 药物芪丹颗粒配方，由黄芪、三七、丹参、山楂等4味中药组成。本实验中所应用的芪丹颗粒方是按芪丹颗粒原方比例（黄芪∶三七∶丹参∶山楂=5∶4∶4∶3）水煎制成汤剂。中药材源自康美药业。盐酸二甲双胍片（商品名：格华止，中美上海施贵宝制药有限公司生产，批准文号：国药准字H200223370）。

1.3 试剂与仪器链脲佐菌素（STZ，美国Sigma-Aldrich 公司）；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等双抗体夹心法酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海Abmart 公司）；胰岛素ELISA试剂盒（北京Dogesce 公司）；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、AS160、磷酸 化AS160（p-AS160）、GLUT4 等 抗 体（上 海Abmart 公司）。血糖仪（美国雅培保健医疗公司）；离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；全自动化学发光仪（上海天能公司）；荧光定量PCR 仪、凝胶电泳仪、电转仪（美国Bio-Rad公司）。

1. 4 分组与造模60 只大鼠适应性喂养1 周后，随机分为6 组，但由于设计不当，剔除1 组，余组为正常组、模型组、芪丹颗粒低剂量组、芪丹颗粒高剂量组及二甲双胍组，每组10 只。除正常组外，其他各组（均为造模组）大鼠建立T2DM 模型[6]。造模方法：造模组给予高糖高脂饲料[粗蛋白≥15.0%，粗脂肪≥12.0%，粗纤维≤5%，粗灰分≤8%，水分≤10%，钙0.8% ～1.6%，总磷0.5%～1.0%，由小黍有泰（北京）生物科技有限公司配制]喂养，正常组则给予普通饲料喂养。饮食诱导4 周后，造模组给予2 次（非同日）腹腔注射小剂量1% STZ 溶液（30 mg/kg），正常组则给予腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。以大鼠3次不同日空腹血糖大于11.1 mmol/L，随机血糖大于16.7 mmol/L判断为成模标准[7]。46只大鼠造模成功。

1.5 干预方法大鼠灌胃给药剂量按照《药理实验方法学》[8]中“人和动物体表面积折算等效剂量比值表”计算所得。芪丹颗粒低剂量组、芪丹颗粒高剂量组分别给予5.58、11.16 g·kg-1·d-1芪丹颗粒方的煎液灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍0.16 g·kg-1·d-1蒸馏水混悬液灌胃，连续4周。

1.6 观察指标与方法

1. 6. 1 大鼠一般情况监测 记录大鼠的活动状态、精神状态、毛发的光泽及柔顺度、饮水量、排泄量、体质量和存活率。

1.6.2 空腹血糖检测 干预前、干预后，测量空腹血糖前12 h 撤食不撤水，尾静脉采血，血糖仪检测空腹血糖。

1. 6. 3 血脂谱检测 按照试剂盒说明书，采用ELISA 法应用多功能酶标仪检测血清总TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1. 6. 4 胰岛素抵抗指数检测 按照试剂盒说明书，采用ELISA 法应用多功能酶标仪检测血清空腹胰岛素，并计算稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。HOMA-IR=空腹血糖（mmol·L-1）×空腹胰岛素（μU·mL-1）/22.5。

1.6.5 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测肝脏组织中PI3K、Akt、AS160 和GLUT4 的mRNA表达 使用TRIzol 法提取肝脏组织中的总mRNA，使用逆转录试剂盒将mRNA 逆转录为cDNA，以cDNA 为模板进行目的基因扩增。PCR 反应条件为：95 ℃预变性25 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃退火60 s，继续反应共40 个循环；72 ℃延展5 min。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。内参为GAPDH。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1. 6. 6 Western Blot 法检测肝脏组织PI3K、Akt、AS160 和GLUT4 的蛋白表达 使用RIPA 裂解液裂解细胞30 min，并在4 ℃离心收集蛋白上清液。二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，99 ℃加热10 min 使蛋白变性。每孔加入20 μg蛋白样品，恒压110 V电泳约1.5 h，将凝胶中分离的蛋白在恒压80 V 条件下转印至甲醇浸泡过的PVDF 膜上。5%脱脂牛奶常温封闭PVDF 膜1 h。加入一抗稀释液（1∶1 000）4 ℃孵育PVDF 膜过夜，PBS 洗膜3 次后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶2 000）室温孵育PVDF膜1 h，PBS 洗膜3 次后应用化学发光仪进行曝光，分析各组蛋白的变化情况。内参为β-actin。

1.7 统计方法采用SPSS 23.0统计分析软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用SNK-，q检验。使用GraphPad Prism 8.0 作图。检验水准，α=0.05，即，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较在活动能力和精神状态方面：各组无明显差异。在毛发的光泽及柔顺度方面：正常组大鼠毛发干洁柔顺有光泽，各药物干预组次之，模型组大鼠相对较其他组大鼠而言，毛发无光泽，毛发脱落较多。在饮水量方面：造模前，各组大鼠饮水量无明显差异；造模后，模型组饮水量远多于正常组及各药物干预组。在排泄量方面：造模前，各组无明显差异；造模后，除正常组，其他各组大鼠排泄量明显增多，垫料需每日1次更换甚至每日2 次更换，其中模型组在相同垫料量的前提下，垫料浸湿的程度更大；干预后，各药物组的饮水量及排泄量较模型组减少，垫料臭气亦减轻。

存活率：正常组和二甲双胍组大鼠均存活；模型组大鼠由于皮肤感染死亡1 只，剩余9 只；芪丹颗粒低剂量组不明原因死亡1只大鼠，剩余9只；芪丹颗粒高剂量组大鼠均存活。

体质量：各组大鼠给药后的体质量均较给药前增加。图1结果显示，正常组大鼠体质量增加最快，模型组体质量增加的幅度低于正常组（P＜0.05），而各给药组体质量增加幅度低于模型组（P＜0.05）。

图1 各组大鼠体质量变化比较Figure 1 Comparison of changes in body mass among each group of rats

2.2 各组大鼠空腹血糖变化比较图2-A 结果显示：干预前，与正常组比较，其他各组（均为造模组）大鼠空腹血糖显著升高（P＜0.01）；模型组、芪丹颗粒低、高剂量组与二甲双胍组间空腹血糖比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2-B ～C 结果显示：干预后，模型组大鼠空腹血糖显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组比较，芪丹颗粒低、高剂量组及二甲双胍组大鼠空腹血糖均降低，其中，芪丹颗粒高剂量组和二甲双胍组与模型组的差异有统计学意义（P＜0.05）。

2. 3 各组大鼠血脂谱变化比较图3 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C值升高，HDL-C 值降低（均，P＜0.01）；与模型组比较，芪丹颗粒低、高剂量组及二甲双胍组的TC、TG、LDL-C 值均有所降低，HDL-C 值有所升高，其中，芪丹颗粒高剂量组和二甲双胍组与模型组的差异有统计学意义（P＜0.05 或，P＜0.01），且这2 组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠胰岛素抵抗情况比较图4 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠HOMA-IR 值升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组的HOMA-IR值均有所下降，其中，芪丹颗粒高剂量组和二甲双胍组显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且这2组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组大鼠胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较Figure 4 Comparison of insulin resistance index（HOMA-IR）among each group of rats

2. 5 各组大鼠肝脏组织PI3K、Akt、AS160 和GLUT4的mRNA 表达比较图5结果显示：与正常组比较，模型组PI3K、GLUT4 的mRNA 表达量降低（P＜0.05 或，P＜0.01），Akt、AS160 的mRNA 表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，芪丹颗粒低、高剂量组PI3K、GLUT4、Akt的mRNA 表达量升高（P＜0.05或，P＜0.01），二甲双胍组PI3K、GLUT4 的mRNA 表达量显著升高（P＜0.01）；芪丹颗粒低、高剂量组上述指标与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图5 各组大鼠肝脏组织中PI3K、Akt、AS160和GLUT4的mRNA表达比较Figure 5 Comparison of mRNA expressions of PI3K，Akt，AS160 and GLUT4 in liver tissue among each group of rats

2. 6 各组大鼠肝脏组织PI3K、Akt、AS160 和GLUT4的蛋白表达比较图6结果显示：与正常组比较，模型组的PI3K、AS160 蛋白表达量无统计 学差异（P＞0.05），而p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AS160、GLUT4 蛋白表达量均降低（P＜0.01）；与模型组比较，芪丹颗粒低、高剂量组及二甲双胍组的p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AS160、GLUT4的蛋白表达量均显著升高（P＜0.01），Akt、p-PI3K、p-Akt、GLUT4 呈剂量依赖性；芪丹颗粒低、高剂量组上述指标与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图6 各组大鼠肝脏组织PI3K、AS160、Akt及其磷酸化蛋白与GLUT4的蛋白表达变化比较Figure 6 Comparison of protein expression changes of PI3K，AS160，Akt and their phosphorylated proteins with GLUT4 in rat liver tissue among each group of rats

3 讨论

2 型糖尿病（T2DM）归属于中医学“消渴病”范畴。《素问·奇病论》有云：“有口甘之病，名为脾瘅，因过度食用甜美食物而多肥胖，肥者使人内热，甜者使人中满，故气上溢，化为消渴之病。”张介宾指出：“消渴病，其为病之肇端，皆膏粱肥甘之变。”芪丹颗粒的临床应用正是本着对消渴病“脾虚为本，痰瘀为标”的认识而建立发展的，其因具有健脾化痰、祛瘀降浊之功而在临床多获良效，能够较好地改善T2DM 患者的胰岛素抵抗。方中：黄芪性微温，味甘，能补肺益气，升清健脾，为君药；丹参微寒，味苦，活血祛瘀，清心凉营，与性温、微苦的三七合用，可加强活血化瘀通络之功效，共为臣药；佐以酸甘温之山楂，可健脾胃、消积食兼活血化瘀。四药共奏健脾益气化痰、化瘀通络之效。本团队前期临床观察芪丹颗粒治疗120 例脾虚痰瘀型T2DM 疗效，结果发现，芪丹颗粒治疗8周后的有效率与二甲双胍治疗结果相当，且在改善胰岛素抵抗、血脂谱以及提高脂联素水平方面优于二甲双胍，提示芪丹颗粒可通过调节脂肪激素的分泌改善T2DM胰岛素抵抗[4]。本研究结果显示，芪丹颗粒可在一定程度上降低T2DM 大鼠空腹血糖，改善TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平，降低胰岛素抵抗指数，减轻大鼠体质量，表明芪丹颗粒可有效改善T2DM大鼠胰岛素抵抗，且与二甲双胍相当。

PI3K-Akt 信号通道在哺乳动物的葡萄糖稳态调节、肌肉功能调节、脂肪形成和脂质调节过程中扮演着重要角色。PI3K 是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，其激活途径主要有2种方式：一是与连接蛋白或带有磷酸化酪氨酸残基的生长因子共同作用，使其构象改变而自我激活；二是通过与Ras和p110 直接结合而活化。PI3K 的活化导致质膜上的PIP3产生，其与PDK1结合后，磷酸化Akt Ser308，激活Akt，参与细胞存活、生长以及调节糖脂代谢[9]。胰岛素抵抗过程中，降低的Akt 磷酸化导致GLUT4 无法从细胞浆转移到细胞膜而不能发挥葡萄糖转运的作用，这会导致血糖升高[10-11]。T2DM患者普遍存在胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗现象，致使Akt 底物AS160 无法调控葡萄糖转运体（GLUT）向膜转运，从而抑制心肌细胞对葡萄糖的摄取[12]。GLUT4主要在胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中表达，在葡萄糖的摄取和代谢过程中发挥重要作用[13]。临床常用的口服降糖药如二甲双胍、格列美脲和噻唑烷二酮类药物等均能促进GLUT4 转位和增加GLUT4 表达，发挥降糖作用[14]。据报道，增强骨骼肌中GLUT4 的表达可以改善小鼠的血糖控制[15]。本研究结果表明，芪丹颗粒可促进T2DM 大鼠PI3K 活化，刺激下游Akt、AS160 磷酸化表达水平升高，进而促进GLUT4 葡萄糖转运过程，降低血糖。提示芪丹颗粒可通过激活PI3K/Akt/AS160/GLUT4 信号通路改善T2DM大鼠胰岛素抵抗。

综上所述，芪丹颗粒对T2DM 胰岛素抵抗大鼠模型具有良好的疗效，可明显改善血脂代谢，可能是通过激活PI3K/Akt/AS160/GLUT4 信号通路控制血糖起作用。