冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4 对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究

罗帅，陈勇

（上海健康医学院附属崇明中心医院，上海 202150）

根据病理表现可以将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占肺癌全部的80%～85%[1]。虽然医学上已经取得了进步，但是非小细胞肺癌的复发转移仍是当前其治疗的难点[2-3]。冬凌草又称为冰凌草，性微寒，甘微苦，常用于治疗咽喉肿痛、蛇虫咬伤和扁桃体炎等疾病[4]，具有多种化学活性，如冬凌草甲素具有明显的抗肿瘤效果[5]。有研究结果显示，冬凌草甲素抑制肺癌细胞A549 的增殖[6]，促进肺癌细胞的自噬小体的产生，并诱导细胞凋亡[7]。肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）位于染色体17q11-12 上，与肿瘤坏死受体家族信号转导密切相关[8]。有研究发现，miR-370 通过靶向负调控TRAF4 抑制肺癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡[9]。但是关于冬凌草甲素是否能够联合TRAF4 影响非小细胞肺癌的研究尚不明确，因此，本研究通过体外培养A549 细胞，探讨冬凌草甲素联合TRAF4 对细胞自噬和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 A549 细胞购自美国ATCC公司；冬凌草甲素购于成都普菲德公司；DMEM 培养基和胎牛血清购于Hyclone 公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒购于北京索莱宝公司；Lipofectamine 2000 试剂盒购于赛默飞世尔公司；si-NC、si-TRAF4、pcDNA、TRAF4 购于广州锐博生物公司；凋亡试剂盒购于江苏凯基生物公司；B 细胞淋巴瘤2（Bcl-2）相关X 蛋白（Bax）抗体、Bcl-2 抗体、微管相关蛋白1 的轻链3（LC3）Ⅱ抗体、LC3Ⅰ抗体、Beclin 1 抗体、ATG7 抗体、TRAF4 抗体、GAPDH 抗体购于美国Abcam 公司；荧光定量试剂盒、逆转录试剂盒、Trizol试剂购于Promega 公司；引物购于上海吉玛公司。

1.2 细胞培养 在37 ℃、5% CO2培养箱中，A549细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM 培养基。细胞汇合率为80%时，采用胰蛋白酶进行消化传代。

1.3 噻唑蓝（MTT）检测细胞活力 取对数生长期A549 细胞并接种在96 孔板中。过夜培养后，细胞与0、1、5、10、20、50 μmol/L 的冬凌草甲素孵育48 h。随后，细胞与MTT 试剂孵育4 h，然后用二甲基亚砜（DMSO）试剂溶解结晶。利用酶标仪检测吸光度值，评估细胞活力。

1.4 细胞分组 A549 细胞接种6孔板内（1×105个/mL），细胞贴壁生长后加入0、20 μmol/L 的冬凌草甲素，记为对照组、冬凌草甲素组。按照Lipofectamine 2000 说明书进行细胞转染。A549 细胞转染si-TRAF4和si-NC，记为si-TRAF4 组、si-NC 组；将pcDNA和TRAF4 转染至A549 细胞后，采用20 μmol/L 的冬凌草甲素处理，记为冬凌草甲素+pcDNA 组、冬凌草甲素+TRAF4 组。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取1．4 各组A549细胞，取1 mL 细胞液添加至500 μL 结合缓冲液内，用于制备细胞悬液。细胞与Annexin V-FITC 和PI试剂孵育，利用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.6 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达 取1．4 中各组A549 细胞4 ℃裂解30 min，然后经过12 000 r/min（离心半径为15 cm）离心10 min，收集细胞上清液，根据BCA 法定量蛋白浓度，在95 ℃变性7 min。取蛋白样品经过凝胶电泳处理，转膜，转膜结束后封闭培养1．5 h，洗膜3 次，加入Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7 和TRAF4 抗体于4 ℃过夜培养，洗膜3 次，加入二抗，室温培养1．5 h，滴加提前配置的显影液，显色、曝光。用Image J 软件分析蛋白条带。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA 表达 利用Trizol 试剂提取总RNA，分光光度计检测RNA 样品的浓度和纯度。逆转录法合成cDNA，然后根据荧光定量试剂盒说明书进行PCR扩增反应。以GAPDH 为内参，分析采用2-ΔΔCt公式计算TRAF4 mRNA 表达量。TRAF4 上游引物为：5’-CATCCACAGTGAGGAGGGCT-3’，下游引物为：5’-TTCATGGGGCAGCGATTAG-3’；GAPDH 上游引物为：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游引物为：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21．0 软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0．05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度冬凌草甲素对A549 细胞活力的影响 评估浓度为0、1、5、10、20、50 μmol/L 的冬凌草甲素对A549 细胞活力的影响。结果显示，A549 细胞活力随着冬凌草甲素浓度的上升而逐渐下降（P＜0．05）。A549 细胞半数抑制率（IC50）为22．4 μmol/L，因此本研究选择20 μmol/L 进行后续实验。见表1。

表1 不同浓度冬凌草甲素对A549 细胞活力的影响（±s）Tab.1 Effects of different concentrations of oridonin on A549 cell viability（±s）

表1 不同浓度冬凌草甲素对A549 细胞活力的影响（±s）Tab.1 Effects of different concentrations of oridonin on A549 cell viability（±s）

注：与0 μmol/L 组比较，*P＜0．05

冬凌草甲素浓度细胞活力0 μmol/L99．2±8．7 1 μmol/L91．2±8．2*5 μmol/L83．2±7．9*10 μmol/L68．4±7．2*20 μmol/L46．5±5．3*50 μmol/L32．4±3．8*F 124．516 P 0．000

2.2 冬凌草甲素对A549 细胞凋亡的影响 与对照组相比，冬凌草甲素组的细胞凋亡率、Bax 水平显著升高（P＜0．05），Bcl-2 水平显著下降（P＜0．05）。见图1、表2。

图1 冬凌草甲素对A549 细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of oridonin on apoptosis of A549 cells

表2 冬凌草甲素对A549 细胞凋亡的影响（±s）Tab.2 Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells（±s）

表2 冬凌草甲素对A549 细胞凋亡的影响（±s）Tab.2 Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05。

组别细胞凋亡率（%）BaxBcl-2对照组7．5±0．90．23±0．020．85±0．06冬凌草甲素组23．4±1．9*0．77±0．07*0．35±0．04*t 22．68922．25220．801 P 0．0000．0000．000

2.3 冬凌草甲素对A549 细胞自噬的影响 与对照组相比，冬凌草甲素组的Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 蛋白表达显著增加（P＜0．05）。见图2、表3。

图2 冬凌草甲素对A549 细胞自噬的影响Fig.2 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells

表3 冬凌草甲素对A549 细胞自噬的影响（±s）Tab.3 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells（±s）

表3 冬凌草甲素对A549 细胞自噬的影响（±s）Tab.3 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05。

组别Beclin 1LC3Ⅱ/LC3ⅠATG7对照组0．27±0．030．32±0．040．22±0．02冬凌草甲素组0．68±0．06*1．25±0．11*0．64±0．05*t 18．33623．83723．398 P 0．0000．0000．000

2.4 冬凌草甲素对A549 细胞中TRAF4 表达的影响 qRT-PCR 和Western Blot 检测结果显示，与对照组相比，冬凌草甲素组的TRAF4 mRNA 和蛋白表达显著降低（P＜0．05）。见图3、表4。

图3 冬凌草甲素对TRAF4 蛋白水平的影响Fig.3 Effect of oridonin on TRAF4 protein level

表4 冬凌草甲素对TRAF4 水平的影响（±s）Tab.4 Effect of oridonin on TRAF4 levels（±s）

表4 冬凌草甲素对TRAF4 水平的影响（±s）Tab.4 Effect of oridonin on TRAF4 levels（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05。

组别TRAF4 mRNATRAF4 蛋白对照组0．95±0．070．71±0．07冬凌草甲素组0．41±0．04*0．33±0．03*t 20．09414．969 P 0．0000．000

2.5 干扰TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响 与si-NC 组相比，si-TRAF4 组的TRAF4 mRNA和蛋白表达显著降低（P＜0．05），细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 水平显著上升（P＜0．05），Bcl-2 水平显示下降（P＜0．05）。见图4、表5。

图4 干扰TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响Fig.4 Effect of interference TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells

表5 干扰TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响（±s）Tab.5 Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（±s）

表5 干扰TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响（±s）Tab.5 Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（±s）

注：与si-NC 组比较，*P＜0．05。

组别TRAF4 mRNA TRAF4 蛋白 细胞凋亡率（%）BaxBcl-2Beclin 1LC3Ⅱ/LC3IATG7 si-NC0．92±0．070．77±0．057．3±0．70．32±0．040．63±0．060．30±0．020．44±0．050．36±0．03 si-TRAF40．37±0．04*0．35±0．03*22．4±2．1*0．59±0．06*0．34±0．03*0．61±0．05*1．32±0．13*0．65±0．06*t 20．46621．60920．46411．23312．96917．27018．95412．969 P 0．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．000

2.6 冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响 与冬凌草甲素+pcDNA 组相比，冬凌草甲素+TRAF4 组的TRAF4 mRNA 和蛋白表达显著增加（P＜0．05），细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 水平显著下降（P＜0．05），Bcl-2 水平显示上升（P＜0．05）。见图5、表6。

图5 冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响Fig.5 Effect of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells

表6 冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4 对A549 细胞凋亡和自噬的影响（±s）Tab.6 Effects of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（±s）

注：与冬凌草甲素+pcDNA 组比较，*P＜0．05。

组别TRAF4 mRNA TRAF4 蛋白细胞凋亡率（%）BaxBcl-2Beclin 1LC3Ⅱ/LC3ⅠATG7冬凌草甲素+pcDNA0．36±0．030．29±0．0222．7±2．10．82±0．070．33±0．030．72±0．061．29±0．130．68±0．06冬凌草甲素+TRAF40．68±0．07*0．52±0．04*14．3±1．2*0．47±0．05* 0．66±0．05* 0．47±0．04*0．85±0．07*0．40±0．04*t 12．60515．42910．41912．20616．97810．4018．94011．649 P 0．0000．0000．0000．0000．0000．0000．0000．000

3 讨论

冬凌草甲素是从冬凌草二萜类化合物内提取分离而来的，具有明显的抗肿瘤作用，如抑制细胞增殖和转移、促进细胞凋亡等[10]。吴楠等[11]研究结果显示，冬凌草甲素通过抑制TPX2 促进前列腺癌细胞的凋亡，阻滞细胞周期，抑制细胞的增殖。研究发现，冬凌草甲素在宫颈癌研究中可以抑制宫颈癌细胞的增殖，促进线粒体凋亡[12]。黄陈翼等[13]在研究骨髓瘤中发现，冬凌草甲素通过抑制磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路促进骨髓瘤细胞的凋亡和抑制细胞增殖。本研究采用不同浓度（0、1、5、10、20、50 μmol/L）冬凌草甲素作用A549 细胞，MTT 实验检测细胞的活力，结果显示，冬凌草甲素呈剂量效应降低，因此本研究采用20 μmol/L（接近IC50浓度）进行后续实验，检测冬凌草甲素作用A549细胞后的机制研究。

凋亡在癌症的发展中具有重要的作用，Bax 和Bcl-2 是Bcl-2 家族的成员，Bax 在细胞发生凋亡时起到促进作用，其过度表达可与Bcl-2 拮抗促使细胞发生凋亡[14]。自噬在细胞代谢和生长发育中至关重要，是一个进化保守的饥饿应答过程，Beclin 1 是一种转运蛋白，可将LC3 自噬蛋白转移至自噬体膜内间接促进细胞的自噬[15-16]。LC3 是自噬标志的相关蛋白，主要两种亚型LC3Ⅱ、LC3Ⅰ，LC3Ⅰ没有活性，LC3Ⅱ可与线粒体受体蛋白结合促进细胞的自噬；LC3Ⅱ与LC3Ⅰ比值可以反映自噬体情况[17-18]。此外，LC3-I 被Atg7 活化，然后在膜内与磷脂酰乙醇胺（PE）偶联生成被加工的LC3-Ⅱ。本研究结果显示，冬凌草甲素能促进细胞的凋亡率，上调Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7 蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，提示冬凌草甲素可以诱导A549 细胞的凋亡和自噬。

TRAF4 在多种细胞高表达，是一种致癌基因，最早在乳腺癌内发现，可以广泛参与癌细胞的发展，通过抑制TRAF4 抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡等[19-20]。陈刚等[21]研究结果显示，TRAF4 在非小细胞肺癌细胞内表达上调，生物信息学网站预测显示TRAF4 是miR-615-5p 的靶标，miR-615-5p 通过靶向负调控TRAF4 发挥在非小细胞肺癌中的作用。有研究发现，利用干扰沉默技术，干扰TRAF4通过抑制Notch1 通路促进肺癌细胞的凋亡和抑制细胞增殖[22]。本研究结果显示，冬凌草甲素作用A549 细胞后，TRAF4 mRNA 和蛋白表达下调，抑制TRAF4 明显增加细胞凋亡率，下调TRAF4 mRNA 和蛋白表达，上调Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7蛋白表达，下调Bcl-2 蛋白表达，说明抑制TRAF4可以促进A549 细胞的凋亡和自噬。深一步研究结果显示，过表达TRAF4 可以逆转冬凌草甲素对A549细胞的凋亡和自噬的影响，提示冬凌草甲素通过联合TRAF4 发挥在非小细胞肺癌中的作用。

综上所述，冬凌草甲素能够促进非小细胞肺癌细胞的凋亡和自噬，其作用机制可能与下调TRAF4有关。本研究探究了冬凌草甲素靶向治疗非小细胞肺癌的分子理论基础，然而，其是否还有其他途径参与冬凌草甲素的抗癌作用仍需要深入探索。