2，6-二氨基-3，5-二硝基-1-氧吡嗪的高效液相色谱分析技术

陈 玲，赵颖彬，冯志强，张 勇，蒋丽春

（1.中国工程物理研究院化工材料研究所，四川 绵阳 621999； 2.中物院含能材料测试评价中心，四川 绵阳 621999）

0 引 言

2，6-二氨基-3，5-二硝基-1-氧吡嗪（ANPZO）是美国劳伦斯·利弗莫尔实验室（LLNL）1994 年报道的一种高能低感耐热单质炸药［1-5］，能量比三氨基三硝基苯（TATB）高25%，爆热约为奥克托今（HMX）的85%，爆速达8560 m·s-1，热安定性与TATB 接近（差示扫描量热放热峰值354 ℃），有望代替TATB 用于战略武器及其它特殊用途的武器，如作为传爆药或主装药用于战略武器和有抗过载能力要求的钻地武器。

国际相关学者对ANPZO 炸药有极大的兴趣。1997 年，Pagorig P E 等［6-8］报 道 了ANPZO 的 合 成 方法，总收率36%，但存在硝化温度过高、易冒料，工艺难以放大等缺点。为了克服这些缺点，Tran T D 等［9］改进了合成工艺，相应的配方研制与定型工作在2003年就已纳入美国能源部重点研究计划。德国和英国也相继开展了该化合物的合成与应用研究。但目前国外对ANPZO 的研究工作主要集中在改进合成途径、降低成本、工艺放大以及进一步评价其性能并进行配方验证等［6-12］。

我国于2004 年首次合成了钝感含能材料ANPZO［13-14］，是以2，6-二氯吡嗪为原料，经过取代、硝化、氨化、氧化4 步反应合成，经元素分析、红外光谱、质谱、核磁共振对合成产物进行结构表征，确认为目标产物，总产率大于36%。随后，国内科研工作者对ANPZO 进行了大量的研究，如不同形貌晶体制备［15-16］，放大制备［17-18］，几何结构优化、自然键轨道分析、振动光谱分析以及成键轨道分析［19-20］，性能表征［21-24］等，但是未见ANPZO 含量分析方法的文献报道，这不利于ANPZO 的质量控制，也影响到ANPZO在钝感传爆药、超高温石油射孔弹等领域的应用研究，因此建立ANPZO 定量分析方法非常必要。

本研究通过流动相、洗脱程序、检测波长等较系统的实验条件研究建立了ANPZO 含量分析方法，同时可以测定ANPZO 中可能存在的主要杂质ANPZ 的含量，为ANPZO 单质炸药的质量控制提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

甲醇（MeOH，色谱纯），三氟乙酸（TFA，色谱纯），二甲基甲酰胺（DMF，分析纯），一级水（纯水机制备），2，6-二甲氧基吡嗪（DMP，自制）、2，6-二甲氧基-3，5-二硝基吡嗪（DMDNP，自制）、2，6-二氨基-3，5-二硝基吡嗪（ANPZ，自制），ANPZO 参比样（批号ANPZO（B）-20001，ANPZO（B）-20004，ANPZO（B）-20005，ANPZO（B）-30000，纯度≥99.5%），ANPZO 试样（化工材料研究所、575 厂或805 厂提供）。

0.1%三氟乙酸溶液（0.1%TFA）：取1 mL 三氟乙酸，用一级水定容至1000 mL，用0.45 μm 有机相滤膜过滤，超声脱气10 min 后密封保存。

高效液相色谱仪，包括G1311C 四元梯度泵，G1316A 恒温柱温箱，G1315D 二极管阵列检测器，G1329B 自动进样器，B.04.05 版化学工作站；分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，分辨力0.01 mg）；THERMO 7148 型超纯水机；超声波预处理器（德国Elmasonic 公司）；0.45 μm 过滤膜（有机相）；50 mL 单标线容量瓶（A 级）。

1.2 试液的制备

1.2.1 标准溶液的配制

选取编号为ANPZO（B）-30000 的参比样，分别称取5.00，10.00，15.00，20.00，25.00，30.00 mg（精确至0.01 mg）于50 mL 容量瓶中，加入二甲基甲酰胺溶剂至容量瓶最高标线以下约2 cm 处。采用超声波振荡器辅助溶解不少于30 min，冷却至室温后定容，得到不同质量浓度的系列标准溶液。用0.45 μm 有机相滤膜过滤出至少5 mL 试液备用。

1.2.2 试样溶液的配制

称取20.00 mg ANPZO 试样（精确至0.01 mg）于50 mL 容量瓶中，加入二甲基甲酰胺溶剂至容量瓶最高标线以下约2 cm 处。采用超声波振荡器辅助溶解不少于30 min，冷却至室温后定容。用0.45 μm 有机相滤膜过滤出至少5 mL 试液备用。

1.3 色谱条件优化

1.3.1 色谱条件

C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱 温30 ℃；进样体积5 μL；流速1.0 mL·min-1；检测波长425 nm；流动相为MeOH-0.1%TFA，采用梯度洗脱，洗脱程序将表1。

表1 ANPZO 含量分析的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution parameter used for ANPZO content analysis

1.3.2 流动相系统考察

依次考察下列流动相洗脱对ANPZO 试样溶液的分离效果。（1）甲醇-水；（2）甲醇-0.1%三氟乙酸溶液；（3）甲 醇-0.5% 三 氟 乙 酸 溶 液；（4）乙 腈-水；（5）乙腈-0.1% 三 氟 乙 酸 溶 液；（6）乙 腈-0.5% 三 氟 乙 酸溶液。

1.3.3 洗脱程序选择

在其他色谱条件不变的情况下，考察等度洗脱程序（甲醇与0.1%三氟乙酸溶液的体积比为5：95）与梯度洗脱程序（表1）对ANPZO 试样溶液中ANPZO 与杂质分离效果的影响。

1.3.4 检测波长确定

对ANPZO 试样溶液进行全波长扫描，根据全波段紫外吸收光谱图结合吸光度值选择最佳检测波长。

1.3.5 定量方法确定

采用1.3.1 推荐的液相色谱条件进样测试1.2.1 配置的不同质量浓度的标准溶液，记录色谱图以及目标峰的峰面积。以标准溶液的质量浓度与目标峰峰面积作图，得到标准工作曲线（多点校正）。同时，选取0.4 mg·mL-1的标准溶液，以通过零点的方式确定一条质量浓度与目标峰峰面积的线性工作曲线（单点校正）。将编号为ANPZO（B）-20001、ANPZO（B）-20004、ANPZO（B）-20005 的ANPZO 参比样当成未知试样，按照1.2.2 的方法分别配置6 份试样溶液，用0.45 μm有机相滤膜过滤后采用1.3.1 推荐的液相色谱条件进样测试，记录目标峰的峰面积。分别以多点校正工作曲线和单点校正工作曲线计算未知试样中ANPZO 含量，考察单点校正和多点校正对定量分析准确性的影响。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性

根据试样溶液浓度将标准曲线的范围设置为0.1～0.6 mg·mL-1。将1.2.1 配置的系列标准溶液按照1.3.1 推荐的液相色谱分离条件进样测试，记录色谱图和目标峰的峰面积，以质量浓度为横坐标，目标峰峰面积为纵坐标绘制曲线图，得出回归方程，考察方法的线性。

1.4.2 检测限和定量限

将0.4 mg·mL-1的ANPZO 标准溶液逐步稀释，用0.45 μm 有机相滤膜过滤后进样测试，分别用3 倍和10 倍信号（S）与噪音（N）比表征ANPZO 的检测限和定量限。

1.4.3 精密度试验

选 取0.4 mg·mL-1的ANPZO 标 准 溶 液，采 用1.3.1 推荐的液相色谱条件重复进样18 次，记录色谱图和目标峰的峰面积，计算ANPZO 含量。按照公式（1）计算相对标准偏差（RSD），以RSD 评估分析结果的精密度。

式中，n为测量次数；xi为测定值；x˭为平均值。

1.4.4 重复性试验

按1.2.2 试样溶液配制步骤平行称取ANPZO 试样8 份配置成试样溶液，分别命名为ANPZO-①～ANPZO-⑧，采用1.3.1 推荐的液相色谱条件进行分离，记录色谱图以及目标峰的峰面积，计算ANPZO含量。

1.5 方法应用

以单点校正峰面积定量测定多批不同合成路线、不同精制阶段的ANPZO 试样中ANPZO 含量。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的建立

2.1.1 流动相的选择

流动相组成与配比是影响分离效果的一个重要因素［25-26］。水是极性最强的溶剂，向其中加入不同浓度的有机溶剂，可以得到不同强度的流动相。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）是反相液相色谱常用的有机溶剂，二者的极性和溶剂强度相差不大，但运用于反相液相色谱还是有一些差异。为选用合适的二元流动相体系，对MeOH 和ACN 进行了比较，结果如图1 所示。

图1 ANPZO 在MeOH 与水混合流动相以及ACN 与水混合流动相条件下的色谱分离图Fig.1 Chromatogram of ANPZO obtained by using methanol/water mixture and acetonitrile/water mixture as mobile phases

由图1 可知，不论是使用MeOH 与水做流动相还是ACN 与水做流动相，ANPZO 都出现严重的拖尾现象，色谱峰对称因子仅0.693。理论分析认为这是因为ANPZO 显弱碱性，在碱性环境下，C18色谱柱的填料硅胶表面的硅羟基会通过阳离子交换电离出未键合的硅醇基团，引起色谱峰拖尾。

根据ANPZO 显弱碱性的特点，在水中加入一定浓度的TFA，使流动相显酸性，抑制色谱柱填料表面的硅羟基活性，减小拖尾，改善峰形。为了考察TFA 对ANPZO 分离效果的影响，比较了0.1%TFA、0.5%TFA以及不含TFA 的流动相条件下ANPZO 的色谱分离图，结果如图2 所示。

图2 不同浓度的TFA 流动相条件下ANPZO 的色谱分离图Fig.2 Chromatogram of ANPZO obtained by using mobile phases with different TFA concentration

由图2 可以看出，不论是使用MeOH 做流动相还是ACN 做流动相，在水中加入一定量的TFA，ANPZO拖尾现象都可以得到缓解，色谱峰峰形改善，对称性提升至0.895 以上。同时，0.1%TFA 与0.5%TFA 对ANPZO 色谱峰峰对称性的改善效果基本没有差别。考虑到高浓度的酸会降低色谱柱柱效和寿命，最终将TFA 的浓度确定为0.1%。

根据ANPZO 的合成工艺［27］推导其可能存在的杂质有2，6-二甲氧基吡嗪（DMP）、2，6-二甲氧基-3，5-二硝基吡嗪（DMDNP）、2，6-二氨基-3，5-二硝基吡嗪（ANPZ）。将ANPZO、ANPZ、DMP、DMDNP 制成混合溶液，在选定色谱条件下，进样5 μL。分别用MeOH 和0.1% TFA、ACN 和0.1%TFA 做流动相进行分离条件试验，结果如图3 所示。

图3 不同流动相下ANPZO 与副产物色谱分离图Fig.3 Chromatogram of ANPZO and by-products obtained by using different mobile phases

比较ANPZO 与杂质的分离效果，发现MeOH 做流动相时，ANPZO 与3 种杂质以及杂质与杂质之间的分离度均大于1.5，而采用ACN 做流动相时，ANPZO虽然与3 种杂质分离开了，但是DMDNP 与DMP 未能完全分离开，因此，采用MeOH 做流动相比ACN 做流动相分离效果更好。

2.1.2 洗脱程序的确定

进行高效液相色谱分析时，常用2 种洗脱方式：等度洗脱和梯度洗脱。试验优化了MeOH-0.1%TFA 等度洗脱和梯度洗脱程序：等度洗脱程序为VMeOH/V0.1%TFA=5%/95%；梯度洗脱程序为0～2 min，5%MeOH；2～7 min，MeOH 由5% 增 加 至100%；7～11 min，100%MeOH。考察了不同洗脱程序下ANPZO 的色谱分离情况，结果如图4 所示。

图4 等度洗脱和梯度洗脱比较图Fig.4 Chromatogram of ANPZO obtained by using isocratic elution and gradient elution

由图4 可知，在优化的等度洗脱程序和梯度洗脱程序下，ANPZO 与杂质都能在最短时间内实现有效分离，且分离度好。但在等度洗脱程序下，ANPZO 的保留时间约10.52 min，而在梯度洗脱程序下，ANPZO 的保留时间仅为6.79 min，保留时间缩短1.5 倍左右，可有效提升分析检测效率。同时，梯度洗脱程序下ANPZO 的峰形更尖锐，更有利于准确定量。

2.1.3 检测波长的确定

在合成ANPZO 的过程中，其杂质2，6-二甲氧基吡 嗪（DMP）、2，6-二 甲 氧 基-3，5-二 硝 基 吡 嗪（DMDNP）已基本去除，副产物主要为未转化完全的ANPZ。因此，将 ANPZO 和ANPZ 在190～600 nm 进行紫外扫描，获得二者的紫外吸收光谱图如图5 所示。

图5 ANPZO、ANPZ 紫外扫描图Fig.5 Ultraviolet spectra of ANPZO and ANPZ

由 图5 可 知，ANPZO 在310 nm 和395 nm 有 较大吸收，ANPZ 在250，310，410 nm 有较大吸收。当吸光度在0.2～0.8 时，浓度测量的相对标准偏差都不大，考虑到样品溶液的配制浓度和比较适宜的吸光度范围，同时为了避免溶剂和杂质的干扰，且符合液相色谱检测的灵敏度和稳定性要求，将波长选在二者有较大吸收且波形平稳的425 nm。

2.1.4 定量方法的确定

归一化法、外标定量法、内标定量法是常用的定量方法［28］。由于归一化法准确定量的前提是所有组分都流出并被成功检测到，而该条件非常难以实现，因此，一般情况下不选用该方法。外标法和内标法均是通过校准曲线实现定量计算的。其中内标法测定结果较为准确，在一定程度上消除了操作条件的变化带来的误差，但是操作较麻烦，且内标物寻找困难。外标法虽然严格要求与标准物操作条件一致，但是操作简单方便，应对大批量样品时有快速、高效的优点，且样品与标准物操作条件一致较容易实现，所以试验选用外标法进行ANPZO 定量。

根据标准溶液数量的不同，外标法可以分为单点校正法和多点校正法。多点校正法通常是采用系列含量不同的标准溶液确定一条浓度值与响应值线性关系的工作曲线，根据试样溶液在工作曲线上的响应值求得其浓度值。而单点校正法是采用与试样溶液相近浓度的一个标准溶液，以通过零点的方式确定一条浓度值与响应值线性关系的工作曲线，然后根据试样溶液在工作曲线上的响应值求得其浓度值。由于实际情况中标准曲线的截距通常不为零，采用单点校正法与多点校正法所得的分析结果可能存在一定的差异。

单点（中间）校正和多点校正获得的3 个批次的ANPZO 参比样纯度结果见表2。由表2 可知，单点校正与多点校正获得的ANPZO 纯度平均值以及标准偏差基本一致，表明多点校正结果与单点校正结果具有一致性。同时，采用单点校正法获得的3 个批次的ANPZO 参比样纯度平均值与该参比样的标称值（99.5%±0.3%）基本一致。这表明采用单点校正法进行ANPZO 纯度测试是准确可行的。因此，在实际工作中，为了提高工作效率，缩短分析测定时间，采用单点校正法来进行ANPZO 纯度定量分析。

表2 单点校正与多点校正结果Table 2 The results of single-point calibration and multi-point calibration

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围

采用1.3.1 推荐的液相色谱分离条件测试不同质量浓度的标准溶液，每个样品重复进样测试2 次，记录色谱图和目标峰的峰面积。以目标峰2 次峰面积（mAu.s）的平均值为纵坐标，标准溶液的质量浓度（mg·mL-1）为横坐标绘制标准曲线，如图6 所示。

图6 ANPZO 标准品的校正曲线Fig.6 Calibration curve of ANPZO standard solution

由图6 可知，在0.1～0.6 mg·mL-1的范围内，ANPZO 的峰面积与质量浓度的线性回归方程为S=3998.6×C+63.124，相关系数R2为0.9996，因此在图6对应的浓度范围内，该方法具有比较好的线性关系。

2.2.2 检测限和定量限

按3 倍信噪比（S/N）计算出检出限为20 ng·g-1，按10 倍信噪比（S/N）计算出定量限为67 ng·g-1。

2.2.3 精密度试验

将0.4 mg·mL-1的ANPZO 标准溶液在1.3.1 推荐的液相色谱条件重复进样18 次，记录ANPZO 色谱峰峰面积，计算ANPZO 含量和相对标准偏差，结果见表3。

表3 精密度试验结果Table 3 Results of precision

由表3 可知，ANPZO 峰面积的相对标准偏差RSD为0.26%，表明建立的ANPZO 纯度分析方法精密度较好。

2.2.4 重复性考察

采用外标法对8 份ANPZO 平行样的色谱峰峰面积进行定量，得到ANPZO 的纯度，计算其重复性相对标准偏差，结果见表4。由表4 可知，8 份ANPZO 平行样的纯度测定值相对标准偏差RSD 为0.30%，说明该方法的重复性较好。

表4 方法重复性实验结果Table 4 The results of repeatability

2.3 方法应用

采用优化的液相色谱分离和定量条件测试多批次不同合成路线、不同精制阶段的ANPZO 试验，计算试样中的ANPZO 含量，结果列于表5。从表5 中可以看出，不同合成路线及精制阶段的ANPZO 试样中ANPZO 含量均不同，表明该方法对于合成工作者及时调整合成路线、优化精制条件有一定的指导意义。

表5 不同ANPZO 产品含量测定结果Table 5 The results of different batches of ANPZO %

3 结 论

（1）建立了基于梯度洗脱的液相色谱ANPZO 含量测试技术。采用SB-C18色谱柱，以甲醇和含0.1%三氟乙酸的水为流动相，在425 nm 检测波长，1.0 mL·min-1的流速下，ANPZO 及反应中间体ANPZ 分离良好，分析时间仅7.0 min。

（2）方法的线性良好，在0.1～0.6 mg·mL-1的范围内，ANPZO 的峰面积与质量浓度的线性回归方程为S=3998.6×C+63.124，相关系数R2为0.9996。

（3）按3 倍信噪比（S/N）计算出检出限为20 ng·g-1，按10 倍信噪比（S/N）计算出定量限为67 ng·g-1。

（4）采用外标法单点校正峰面积对ANPZO 纯度定量，重复性测试结果的相对标准偏差为0.30%。可以用于不同路线、不同条件合成的ANPZO 样品纯度测试，实现产品的质量控制和质量把关。