黄淮海大豆种质资源品质鉴定与优异种质筛选

邵振启， 李文龙， 孔佑宾， 杜汇， 李占军， 李喜焕*， 张彩英*

（1.河北农业大学农学院，华北作物改良与调控国家重点实验室，华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室， 河北 保定 071001； 2.河北省大豆产业技术研究院，石家庄 050000）

大豆（Glycine max）是世界重要粮食和油料作物，为人类提供约50%和25%以上的植物油和蛋白质[1-4]；同时，大豆富含多种有益于人体健康的生物活性物质，如异黄酮、脂肪酸和生育酚等[5-7]。近年来国内外研究主要集中在大豆蛋白质和油分遗传位点及功能基因发掘[8-9]，而对于优异种质鉴定筛选研究甚少，尤其缺少对大豆特有的且能够显著提升经济价值的优异性状的评价和筛选，资源的匮乏严重制约了优质品种的培育。因此，大规模、多环境条件下综合评价大豆多个品质性状，对大豆品质性状遗传改良具有重要意义。

王茹芳等[10]分析了来自河北省的40 份夏大豆品质性状，筛选出4 份蛋白质含量≥44%的品种和9 份油分含量≥21%的品种。怀圆圆等[11]分析了2017、2019 年参加黄淮海多点鉴定的288 份大豆品种，筛选出蛋白质含量>45%的优异种质39 份，油分含量>21.50%的种质1 份，油酸含量>35%的种质1份，异黄酮含量>3 700 µg·g-1的种质1份。何鑫等[12]分析了2006—2017 年参加国家黄淮海区域试验的595 份大豆品种，筛选出4 份蛋白质含量>46%的品种（系）和5 份脂肪含量>22.5%的品种（系）。宁凯等[13]分析2003—2018 年国家审定的黄淮海地区111 个夏大豆品种发现，蛋白质平均含量为41.30%，变幅35.77%~47.05%，油分平均含量为20.68%，变幅17.40%~23.63%。秦宁等[14]分析东北地区299 份大豆品种资源，筛选出13 份总生育酚含量高的优异种质，其中‘合丰50’的生育酚含量最高，为351.36 µg·g-1。上官文秀等[15]分析了327 份大豆品种资源（主要来自河南、河北、山东和山西等地）生育酚及其组分含量，筛选出5份高生育酚含量种质。

研究证实，大豆品质性状是由多基因控制的复杂数量性状[16-18]，因此，只有构建大规模群体，在多环境条件下才能获得品种的真实特性。鉴于此，本研究在多年、多环境条件下对来自黄淮海生态区的520份大豆品种（系）的16个籽粒品质性状进行分析，研究其遗传变异，分析性状间的相关性，并进行性状主成分分析及品种聚类分析，同时结合品种在不同环境条件下的稳定性，筛选综合性状优良的优异种质，为实现黄淮海大豆品质性状同步改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的520 份大豆种质资源由本实验室收集保存，包括61份地方品种和459份育成品种（系），均来自黄淮海大豆生态区，其中，安徽省28 份、北京市99 份、河北省225 份、河南省54 份、山东省62 份、山西省35 份、江苏省12 份、陕西省4 份、内蒙古自治区1份。

试验所用化学试剂硫酸钾、无水硫酸铜和氢氧化钠规格为500 g·瓶-1，色谱甲醇、色谱乙酸、色谱乙腈、正己烷和色谱乙醇规格为500 mL·瓶-1，均购自天津福晨化学试剂有限公司。98%浓硫酸规格为500 mL·瓶-1，购自天津科密欧化学试剂。

1.2 试验设计与田间种植

520份供试大豆品种资源于2019—2020年在3个不同省份种植，即2019年河北保定（E1）、2019年河南原阳（E2）、2019 年山东临清（E3）、2020 年河北保定（E4）、2020 年河南原阳（E5）、2020 年山东临清（E6）。所有试验均采用完全随机区组设计，3 次重复，行长2.5 m，行距0.5 m，株距0.1 m。大豆植株成熟后，连续收获中间5 株，混合脱粒，用于籽粒品质性状测定。

1.3 大豆籽粒品质性状测定

1.3.1蛋白质含量测定 挑选饱满且无病斑大豆籽粒50 粒，利用破壁机粉碎，过60 目筛得到大豆粉末。称取0.2 g大豆粉末至250 mL消煮管，加入催化剂（7 g 硫酸钾+0.2 g 无水硫酸铜），然后加入12 mL 浓硫酸，轻轻摇动，将样品浸湿；将消煮管放置于福斯消煮炉，420 ℃消煮90 min，取出消煮管室温冷却15 min，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[19],利用福斯全自动凯氏定氮仪测定蛋白质含量。

1.3.2脂肪含量测定 挑选饱满且无病斑大豆籽粒50 粒，参照GB/T 15690—2008《植物油料含油量测定连续波低分辨率核磁共振测定法(快速法)》[20]，利用布鲁克核磁共振仪测定脂肪含量。

1.3.3异黄酮含量测定 称取大豆粉末30 mg，置于2 mL 离心管，加入1.5 mL 80%甲醇水溶液，60 ℃超声提取90 min，每隔30 min 颠倒混匀15 s，12 000 r·min-1离心15 min；用1 mL 注射器吸取上清800 µL，过0.22 µm 滤膜，转移至2 mL 进样瓶；利用安捷伦高效液相色谱测定异黄酮含量，流动相A：0.1%乙酸乙腈，流动相B：0.1%乙酸水，洗脱梯度见表1，色谱柱为喆分Supfex JX-C18，检测波长260 nm，柱温40 ℃，流速1 mL·min-1，进样量10 µL。

表1 异黄酮含量测定洗脱梯度Table 1 Elution gradient for isoflavone content analysis

1.3.4脂肪酸含量测定 称取大豆粉末30 mg，置于2 mL离心管，加入1 mL正己烷，60 ℃水浴20 min，每隔5 min 颠倒混匀20 s，加入1 mol·L-1甲醇钠800 µL，振荡混匀10 min，4 ℃静置30 min，用1 mL注射器吸取上清600 µL，过0.22 µm 滤膜，转移至2 mL进样瓶，待测定。

利用安捷伦高效气相色谱测定脂肪酸含量。色谱柱：安捷伦DB-FastFAME 色谱柱，进样口温度250 ℃，分流比50∶1，载气为氦气，恒压模式14 psi，进样体积1 µL，柱箱温度50 ℃，保持0.5 min；25 ℃·min-1升温至194 ℃，保持1 min；5 ℃·min-1升温至245 ℃，保持3 min；检测器温度280 ℃，检测器气体：氢气40 mL·min-1，空气400 mL·min，尾吹气25 mL·min-1。

1.3.5生育酚含量测定 称取大豆粉末30 mg，置于2 mL 离心管，加入1.5 mL 80%乙醇水溶液，室温超声提取15 min，静置15 min，振荡混匀1 min，室温超声提取15 min，13 000 r·min-1离心20 min，1 mL 注射器吸取上清800 µL，过0.22 µm滤膜，转移至2 mL进样瓶，待测定。

利用安捷伦高效液相色谱测定生育酚含量。流动相A：色谱乙腈，流动相B：色谱甲醇，分流比为9∶1；色谱柱：喆分Supfex JX-C18，检测波长295 nm，柱温40 ℃，流速1 mL· min-1，进样量20 µL。

1.4 数据分析

利用Microsoft Excel 2013 对供试大豆种质资源16 个籽粒品质性状进行统计分析，利用SPSS statistics 25软件进行籽粒性状的主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 供试大豆种质资源籽粒品质性状遗传变异分析

通过对供试大豆种质资源6 种环境条件下的16 个品质性状进行方差分析发现（表2），各品质性状在供试种质间的差异均达到显著水平，说明供试材料种质资源籽粒品质性状存在真实差异；同时发现，各品质性状在不同环境条件下的差异也达到显著水平，说明上述性状同时受环境条件的影响，多年多点鉴定具有重要意义。

表2 供试大豆种质资源籽粒品质性状遗传变异Table 2 Genetic variations of seed quality traits in soybean germplasms

对上述大豆种质资源籽粒品质性状遗传变异结果（表2）分析发现，蛋白质、脂肪、油酸、亚油酸、亚麻酸、总异黄酮和总生育酚平均含量分别为42.55%、18.46%、22.51%、53.04%、6.68%、1 969.03 µg·g-1和282.47 µg·g-1；其相应的变异系数分别为5.00%、7.42%、10.26%、3.49%、11.08%、27.45%和12.15%。可见，异黄酮、生育酚和亚麻酸含量的变异系数较高，说明存在较丰富的遗传变异，具有较大的选择潜力。

2.2 大豆籽粒品质性状相关性分析

对供试大豆种质资源16 个籽粒品质性状相关性进行分析发现（表3），蛋白质与脂肪、不饱和脂肪酸、总异黄酮和总生育酚呈极显著负相关；脂肪与不饱和脂肪酸及总生育酚呈极显著正相关，与总异黄酮呈极显著负相关；不饱和脂肪酸与总异黄酮呈极显著正相关；总异黄酮和总生育酚呈极显著负相关。由此可见，高含油量大豆的选择会同时提高其不饱和脂肪酸及生育酚含量，但会伴随异黄酮含量的降低；高蛋白品种则具有较低的脂肪、不饱和脂肪酸、总异黄酮和总生育酚含量。因此，在大豆籽粒品质性状改良中要注意平衡品质间的关系，才能实现其同步改良。

表3 大豆种质资源16个籽粒品质性状相关性分析Table 3 Correlation analysis of 16 kinds of seed quality traits in soybean

2.3 供试大豆种质资源品质性状主成分分析

对供试大豆种资源16 个籽粒品质性状进行主成分分析发现（表4），前5个主成分的初始特征值分别为3.85、3.20、2.49、1.72 和1.00，均≥1，且累积方差贡献率为76.57%，故选用这5 个主成分代替16个品质性状来评价大豆品质。

表4 主成分分析初始特征值和累积方差贡献率Table 4 Initial eigenvalue and cumulative variance contribution in principal component analysis

在主成分分析中，通过比较每种性状在每个主成分中特征向量绝对值的大小，可反映其对该主成分的贡献率，通过分析初始特征值≥1 的5 个主成分发现（表5），主成分1 主要包含脂肪、亚麻酸、大豆甙、黄豆黄素、染料木甙、总异黄酮、γ-生育酚和总生育酚，该主成分包含的性状最多，累积方差贡献率最大，为24.08%；主成分2 主要包括蛋白质和棕榈酸，累积方差贡献率为19.98%；主成分3 主要包括油酸和亚油酸，累积方差贡献率为15.53%；主成分4 主要包括硬脂酸和不饱和脂肪酸，累积方差贡献率为10.72%；主成分5 主要包括δ-生育酚和α-生育酚，累积方差贡献率为6.26%。

表5 16个大豆品质性状的贡献率Table 5 Contribution rates of 16 seed quality traits in soybean

2.4 供试大豆品种资源综合评价

根据累积方差贡献率和各主成分得分系数，计算520 个大豆种质资源的5 个主成分和综合主成分得分，用于比较供试大豆种质资源品质性状的优劣，经比较发现（表6），‘中作J6012’‘维豆13’‘五星2 号’和‘秦豆13’等品种的综合主成分得分较高。

2.5 大豆品种资源的聚类分析

利用上述5个主成分对520份大豆种质资源进行聚类分析，结果发现，可将其分为3个类群，其中类群Ⅰ包含226个品种（系），其籽粒硬脂酸、不饱脂肪酸、δ-生育酚和α-生育酚含量较高；类群Ⅱ包含172个品种（系），其籽粒脂肪、亚麻酸、大豆甙、黄豆黄素、染料木甙、总异黄酮、γ-生育酚和总生育酚含量较高；类群Ⅲ包含122个品种（系），其蛋白质、棕榈酸、油酸和亚油酸含量较高。进一步对上述聚类结果进行F检验，结果（表7）发现，不同主成分在不同类群间差异达到显著或极显著水平。

表7 供试大豆品种资源的聚类分析Table 7 Cluster analysis of soybean germplasms in the present study

2.6 大豆优异种质筛选

以‘冀豆12’为对照，对供试大豆品种资源在6 种环境条件下的籽粒蛋白质、脂肪、不饱和脂肪酸、总异黄酮及总生育酚含量的高稳系数（high stability coefficient，HSC）进行分析发现，265 个品种（系）的单一性状高稳系数大于1；173 个品种（系）至少有2个性状的高稳系数大于1；不饱和脂肪酸没有发现高稳系数大于1 的品种（系）。基于上述主成分分析、聚类分析及高稳系数分析结果，筛选出35 份多个或单一性状表现优异的大豆种质（表8），其中，多个性状表现优异的大豆种质有‘中黄40’‘邯豆5 号’‘HN-2018’‘沧豆09Y2’‘邯黑豆2 号’‘邯11222’‘中作11N-136’‘邯豆17’‘五星1 号’‘杜士大黄豆’‘荷豆19’‘汾豆09Y2’‘冀14-11’‘承德铁黑豆’‘晋遗46’‘中品95-5383’‘郑99048’‘邯豆3 号’；单个性状表现优异的大豆种质有‘二大粒黄豆’‘10HJ117’‘冀17-4’‘沧豆0841’‘皖豆15’‘冀17-J6’‘汾豆102’‘中作J10152’‘小黑豆’‘中作J9056’‘平顶黄’‘黑豆’‘圣豆102’‘北高晃黑豆’‘中豆32’‘邯9032’‘SN早黄2 号’，这些种质资源可为黄淮海地区大豆品质性状遗传改良奠定重要物质基础。

3 讨论

3.1 参试大豆品种资源品质性状存在广泛遗传变异

黄淮海生态区是我国最重要的大豆驯化中心，受地理和气候因素的影响，黄淮海生态区的大豆品种资源存在丰富的遗传变异[21]。大豆蛋白质、脂肪、异黄酮、脂肪酸和生育酚等成分营养价值高，有益于人体吸收，具有多种保健功能，还可预防多种疾病[22-25]。徐泽俊等[26]分析303 份黄淮海地区大豆品种资源发现，蛋白质和脂肪的变异系数分别为5.52%和7.84%。怀园园等[11]以来自黄淮海地区的288 份大豆种质为材料，研究发现异黄酮变异系数最大，脂肪酸次之，脂肪和蛋白质变异系数较小。本研究通过分析520 份黄淮海生态区大豆种质资源在2 年6 个环境条件下的16 个籽粒品质性状，发现各品质性状中以异黄酮和生育酚含量的变异系数较大，蛋白质、脂肪和脂肪酸含量的变异系数较小，说明异黄酮和生育酚存在较大的选择潜力，而蛋白质、脂肪和脂肪酸含量遗传改良难度较大。

3.2 品质性状间的显著相关为实现多性状同步改良奠定了基础

作物不同性状间存在错综复杂的关系，只有明确并合理平衡这些关系，才能有效提高遗传改良效率。Wang 等[27]和Lee 等[28]研究证实，蛋白质和脂肪含量存在显著负相关；Liang 等[29]通过分析417个株系组成的大豆RIL群体蛋白质、脂肪和异黄酮含量发现，蛋白质与脂肪、异黄酮含量存在显著负相关，其相关系数分别为-0.55 和-0.34；Matei 等[30]研究发现，大豆籽粒蛋白质与脂肪含量呈显著负相关，脂肪与棕榈酸和亚麻酸呈显著负相关，与油酸呈显著正相关，亚油酸与油酸、硬脂酸呈显著负相关，亚麻酸与油酸呈显著负相关。这些结果与本研究对黄淮海生态区大豆种质资源籽粒品质性状相关性分析结果基本一致。

然而，前人报道中有关大豆籽粒蛋白质与脂肪酸、异黄酮和生育酚间的相关性分析较少。本研究发现，大豆籽粒蛋白质与不饱和脂肪酸、总异黄酮和总生育酚间均存在极显著负相关。由此可见，不同品质性状之间既相互促进又相互制约，性状间的差异和相关性为育种提供了选择机会，只有在育种过程中合理搭配，优势互补，才能显著提高育种效率。因此，在今后的大豆品质性状遗传改良中，可根据不同性状间的相关关系协同改良，进而培育出品质性状优异的新品种。

3.3 优异大豆种质的发掘与利用

为进一步为大豆育种杂交亲本选配提供选择依据，本研究首先对520 份供试大豆种质资源的16个籽粒品质性状进行主成分分析，然后基于主成分分析结果对品种进行聚类分析，结果将其分成3类，各类别之间的品质性状差异显著；随后分析了各品种的籽粒蛋白质、脂肪、异黄酮、脂肪酸和生育酚不同环境条件下的高稳系数；综合上述结果，筛选出18份多个性状表现优异的大豆种质。因此，大豆育种中可根据主成分分析-聚类分析-高稳系数分析结果，在不同类群间进行杂交组配，扩大亲本表型的变异范围，实现优势互补，进而培育出品质优良且适应性广的大豆新品种。