芪参桃红颗粒对心力衰竭小鼠心肌重构的干预作用及对自噬相关miRNA的影响

靳嘉麟 刘 静 万 洁 李 冬 逯金金 崔晓云 周 鹍 高 群 李天力 贾文浩 武 乾 李 岩 林 谦

(1 北京中医药大学东直门医院,北京,100700; 2 北京中医药大学,北京,100029; 3 北京中医药大学东方医院,北京,100078; 4 中国中医科学院医学实验中心,北京,100700)

心力衰竭(心衰)是因心脏结构及其功能的异常改变所引起的一组复杂临床综合征,心肌组织重构是心衰的主要病理生理过程,反过来也是促进疾病的重要病因,其主要表现包括心脏几何结构改变[1]、心肌纤维面积减少、心肌纤维化、心肌细胞凋亡等[2],并与细胞自噬等生命活动异常变化相关。研究已经表明细胞自噬与心力衰竭等心脏疾病密切相关[3],并且任何过度或不足的自噬过程都会损害心功能[4]。临床心衰患者多属于中医气虚血瘀水停的病机范畴,益气活血利水法是中医治疗心衰的有效方案[5-6]。芪参桃红颗粒(前称为“益气活血利水方”)由林谦教授根据气血理论创制而成,长期应用于临床,疗效肯定[7]。本研究结合既往成果,以芪参桃红颗粒为干预,以自噬激动剂雷帕霉素、阻滞剂3-甲基腺嘌呤为工具药,以阳性药马来酸依那普利片为对照组[8-9],观察在药物干预下,压力负荷心衰小鼠不同时期心功能、心肌重构程度,自噬体形成情况,自噬相关的miRNA表达情况,进一步探究芪参桃红颗粒作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性C57BL/6Cnc小鼠,6～8周龄,100只,体质量(20±3)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产使用许可证书编号:北京SYXK(京)2017-0033.实验动物饲养于中国中医科学院医学实验中心功能实验室,无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级动物房,恒湿恒温,由专业人员使用实验动物无菌饲料饲养。本研究方案已通过北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会审查。

1.1.2 药物 芪参桃红颗粒(QSTH),颗粒剂型,由生黄芪60 g、桃仁10 g、党参15 g、猪苓15 g、泽兰15 g、红花10 g、桑白皮10 g、丹参10 g、葶苈子10 g等组成,该方药由北京中医药大学东方医院生产,每包约25 g。马来酸依那普利片(扬子江药业集团江苏制药股份有限公司,批号:18081011)。

1.1.3 试剂与仪器 雷帕霉素(Sigma公司,美国,货号:529M032);3-甲基腺嘌呤(Sigma公司,美国,货号:097M4018V);Tween-80(北京索莱宝科技有限公司,货号:1114D011);TRIzol RNA提取剂(天根生化科技有限公司,货号:DP405-02);miR cutemiRNA荧光定量试剂盒(天根生化科技北京有限公司,货号:FP401);DL2000 DNA Marker(TaKaRa宝生物公司,日本,货号:3427Q);大体显微镜(Nikon,日本,型号:SMZ745);动物超声心动检查系统(Visual Sonics Inc,美国,型号:Vevo770 ultrasound system);凝胶成像系统(上海天能科技有限公司,型号:Tanon 1600);荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司,美国,型号:ABI7500)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 横向主动脉缩窄(Transverse Aortic Constriction,TAC)导致压力负荷升高的心衰小鼠模型:4%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉。视角由显微镜放大5～10倍,沿左侧胸骨第2肋间,造成3 mm手术切口,钝性分离肌肉,直至暴露主动脉弓。于主动脉前后,区分出无名动脉和左侧颈总动脉,环绕一圈主动脉弓,使用聚丙烯缝6号线将血管连同28-gauge针头一同结扎,结扎后缓慢退出针头,造成固定性缩窄,随后缝合皮肤。术后约4周即可显现出明显心力衰竭。模型组与假手术组手术相同,但假手术组只进行至钝性分离肌肉,游离主动脉弓,只穿线,不结扎。将90只C57小鼠随机分为:模型组(M组)、芪参桃红颗粒组(芪参桃红颗粒简称QSTH,该组为T组)、QSTH+雷帕霉素组(TR组)、QSTH+3-甲基腺嘌呤组(T3M组)、依那普利组(E组),假手术组(S组)。

1.2.2 给药方法 根据随机数表法,造模后的小鼠被随机分配入组,每组动物15只,给药及分组情况如下:S组给生理盐水;M组给予生理盐水;T组给予QSTH[4 g/(kg·d)];TR组给予QSTH[4 g/(kg·d)]+雷帕霉素[2 mg/(kg·d)][10];T3M组给予QSTH[4 g/(kg·d)]+3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)][11];E组给予马来酸依那普利片[0.9 mg/(kg·d)]。中药量为参考临床成人经验用药量与《药理实验方法学》,换算中药QSTH成人剂量至小鼠用量。

1.2.3 检测指标与方法

一般情况监测及心脏病理检测。监测小鼠一般情况,术后2、4周完成超声心动测量后处死,称量、取材并行苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin,HE)及Masson染色,采用image J图像分析系统测定心肌细胞直径;计算心肌细胞胶原容积分数(Collagen Volume Fraction,CVF),随机取切片中5个视野,调节灰度后,区分胶原与非胶原组分,CVF=胶原面积/心肌面积。

1.2.3.1 心功能检测 动物心脏超声无创检测系统[12]:TAC术后2、4周分别检测1次。动态监测心室壁肥厚情况、心室收缩功能:取左心室乳头肌水平短轴位M型超声,检测左室后壁厚度、左室舒张末期内径,左室射血分数、收缩分数。

1.2.3.2 自噬体形成情况监测 各组动物在术后2、4周,检测心功能后处死取新鲜心肌组织,处理后在透射电镜下观察自噬体的形成和分布情况[13]。

1.2.3.3 细胞凋亡检测 各组动物在术后2、4周心肌细胞急性分离后进行凋亡检测,在Adobe Photoshop软件中对各组凋亡细胞染色图像定量分析,以凋亡细胞百分比作为参考值[13]。

1.2.3.4 自噬相关差异miRNA动态表达及靶基因预测 造模后2、4周,进行超声检测后,选取S组、M组、T组,取小鼠左心室组织(≥50 mg),液氮闪冻,-80 ℃条件下储存备测。分步骤进行Total RNA样本检测、文库构建、上机测序及生物信息分析、基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析、差异miRNA动态表达及靶基因预测、qPCR验证关键差异miRNA表达[14-19]。取P<0.05、log2FoldChange绝对值≥1为显著差异条件。

2 结果

2.1 小鼠一般情况监测 手术后各组小鼠均可见萎靡、反应减弱、倦怠。术后2周,S组小鼠逐渐恢复,其他各组均可见不同程度的抓取反应力减弱、纳差、运动能力减弱、毛色光泽差。术后2周内,S组未发生死亡事件;M组5只死亡;E组4只死亡;T组1只死亡;TR组死亡4只;T3M组死亡3只,考虑术后感染或急性心力衰竭致死。

2.2 标准化心脏肺脏质量 术后2、4周,对各组小鼠进行体质量测量,取材并称量心脏及肺脏质量,并将心肺质量比上相应体质量,乘以1 000,以此作为心肺质量标准化(Standardized Heart Weight,SHW;Standardized Lung Weight,SLW)处理。见表1。

表1 各组小鼠心功能比较(n=7)

2.3 左室心功能评价 TAC术后2周时,与S组比较,M组左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)%、左室短轴缩短率(Shortening Fraction,FS)%降低,舒张期左室内径(Left Ventricular End-diastolic Dimension,LVIDd)、舒张期左室后壁厚度(Diastolic Left Ventricular Posterior Wall Thickness,LVPWd)升高;干预组中,M组、TR组、T3M组、E组FS、LVEF不同程度降低,LVIDd升高;M组、E组LVPWd升高。与M组比较,T组LVEF、FS升高,T3R组LVIDd升高,T组、TR组、T3M组LVPWd降低。组间比较,T组、TR组、T3M组、E组LVEF值存在统计学差异。TAC术后4周时,与S组比较,M组FS、LVEF值降低,LVIDd、LVPWd升高;TR组、T3M组、R组FS、LVEF值下降,LVPWd值升高,T组、TR组、T3M组、E组LVIDd值升高。与M组比较,T组、TR组、T3M组、E组FS、LVEF值升高,LVPWd值下降;T组、TR组、E组LVIDd值下降;组间与同组前后自身比较可以发现,TR组、E组FS、LVEF值较前升高,M组FS、LVEF值较前降低;术后4周,TR组较T3M组LVEF值升高,E组较T3M组LVEF组LVEF值升高;TR组、E组、M组LVIDd值较自身升高。见表1。

2.4 左心室病理学检测 除S组,其他组可见不同程度心脏横截面几何形状变形、心肌肥厚、心肌细胞肥大、坏死,周围血管可见血管壁增厚、炎性细胞浸润;定量分析显示,T组和E组相比较其他各组心肌总面积更高(P<0.05)。心肌细胞凋亡检测:T组和E组相比较其他各组,心肌纤维凋亡百分比更低。见图1～3。

图2 各组心肌横截面胶原纤维比较(Masson染色,×400,横截面标尺500 μm,放大图标尺30 μm)注:A. S组,B. M组,C. T组,D. T3M组(QSTH+自噬阻滞药组),E. TR组(QSTH+自噬激动药组),F. E组(阳性对照药组)

图3 各组病理检查定量比较注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;A示心肌纤维直径;B示心肌纤维数量;C示心肌纤维总面积;D示单个心肌纤维面积;E示心肌组织纤维胶原面积百分比;F示心肌纤维凋亡百分比。(3)A. S组,B. M组,C. T组,D. T3M组(QSTH+自噬阻滞药组),E. TR组(QSTH+自噬激动药组),F. E组(阳性对照药组)

2.5 透射电镜观察自噬体 相较于S组，M组、T组、E组、TR组、T3M组各自的自噬滤泡、自噬溶酶体和自噬体数量增加，心肌细胞排列紊乱，线粒体呈现稀疏松散，并且不规则，其内可见被破坏的线粒体结构。术后4周更严重，其中T3M组在心肌纤维细胞和线粒体排列、完整性方面，相对更差。见图4。

图4 各组透射电镜观察自噬超微结构比较(左侧标尺20 μm,放大倍数为5 000倍;右侧标尺10 μm,放大倍数为10 000倍)注:A. S组,B. M组,C. T组,D. T3M组(QSTH+自噬阻滞药组),E. TR组(QSTH+自噬激动药组),F. E组(阳性对照药组)。透射电镜视野中,自噬滤泡的特征为:双层或多层膜,伴新月状或杯状;自噬体的特征为:内含胞浆成分,如核糖体、内质网、线粒体,多为双层,或多层膜的液泡状结构;自噬溶酶体的特征为:胞浆成分被降解的单层膜结构

2.6 基于第二代基因测序技术结合生物信息学分析可能存在的分子机制 差异miRNA表达结果。根据术后2周、4周T组较M组差异miRNA结果,发现术后2周,差异miRNA有miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-708-3p、miR-200b-3p、miR-6715-5p、miR-96-5p、miR-7689-3p、miR-1983、miR-382-5p,术后4周时,差异miRNA有miR-7225-5p、miR-671-5p、miR-677-5p、miR-582-3p、miR-208b-3p、miR-101a-5p、miR-184-3p、miR-181b-2-3p。结合文献,选取关键miRNA进行qPCR验证,经QSTH干预2周后,M组mmu-miR-200a-3p、mmu-miR-200c-3p、mmu-miR-96-5p显著下降;经QSTH干预4周后mmu-miR-671-5p显著下降。见表2,图5。

图5 qPCR验证结果注:T组与M组比较,*P<0.05

表2 术后2周、4周T组较M组差异miRNA

从 miRNA测序及KEGG分析结果可知,M组相较于S组,在差异miRNA富集的多条信号通路中,其中Metabolic、Lysosome通路与细胞自噬联系密切并且富集因子较高、差异显著。在T组较M组的各差异miRNA富集通路中,mTOR、Lysosome通路与自噬密切相关,其中mTOR是调节自噬非常重要的信号通路。KEGG分析结果。结果以KEGG散点图的方式进行展现。见图6～7。

图6 M组对比S组候选靶基因KEGG富集散点图

图7 T组对比M组候选靶基因KEGG富集散点图注:Rich factor(富集因子)指表达有差异的基因中,处于该通路(pathway)条目的基因总数与所有位于该通路中有注释的基因条目的总数的比值。该因子越大,表示富集越发显著。qvalue是经多重假设检验校正的p值,其得出数值的范围为[0,1],越接近于0,表示富集性越强、越显著。Gene_number是该通路富集到的基因数目,数值越大,相应的圆形越大

3 讨论

芪参桃红颗粒(前称益气活血利水方),应用于临床长达十数年,为林谦教授循廖家桢教授临床经验,结合气血理论所创,治疗慢性心力衰竭疗效肯定。该方由生黄芪、党参、桃仁、红花、丹参、桑白皮、葶苈子、猪苓、泽兰组成。方中选取益气、活血、利水之常用药物,以生黄芪、党参大补心脾肺之宗气,宗气充足则血行流畅;以桃仁、红花、丹参活血化瘀,红花兼具散湿之力,使补气而无留滞之虞,使五脏六腑得养以正常行使气化之功;以桑白皮、葶苈子、泽兰、猪苓泻去离经蓄积之水邪,邪去则正安。

慢性心衰是由多种原因持续存在导致的心肌重构及相应的临床综合症状,重构表现包括心肌肥厚、心脏几何形状改变、心肌纤维化和心肌细胞凋亡等[20],进而导致临床中患者运动受限、呼吸困难等主要症状。在心肌重构的过程中,自噬具有密切、双向的作用。在心肌缺血缺氧的情况下,自噬促进细胞内成分循环利用使并以此适应应激刺激,但同时,程序性细胞死亡也可以由自噬触发,并成为促进细胞死亡的因素[21-27],因此,任何过度或不足的自噬都会损害心肌组织。

临床中心衰患者多表现为运动受限及呼吸困难,其主要原因是心脏几何形状改变、心肌细胞缺失造成心室组织不协调、不完全收缩,LVEF值降低,心脏负荷增重,同时导致心室分泌BNP并在活化酶的作用下产生NT-proBNP。本课题组前期通过一项RCT试验证明,芪参桃红颗粒可改善慢性心衰患者中医证候及症状评分、心功能,提升LVEF,降低NT-proBNP,提高患者生命质量[28]。本实验结果显示,相较于M组,芪参桃红颗粒可以降低小鼠标准化心脏比与标准化肺脏重量(心脏、肺脏质量比体质量之后乘以1 000),减小心脏横截面直径、提高LVEF值(P<0.05),提示该方可控制心衰小鼠心脏质量增加,抑制心脏几何形状改变。

除此之外,在重构过程中,心肌细胞整合各个来源的生物信息,将生物力学力信息转化为基因层面的表达[29],并由此引发心肌细胞中的能量代谢异常,进而触发心肌细胞自噬异常,造成心肌细胞凋亡、纤维化以及形状的改变。李岩等[30]进行益气药对慢性心力衰竭模型大鼠能量代谢研究中发现,芪参桃红颗粒的主要组成部分党参、生黄芪可以维持总肌酸激酶活性,维持肌酸激酶同工酶及腺苷酸转位酶2种异构体mRNA转录表达,保证心衰大鼠心肌能量物质体系的正常运行,改善心肌运动功能;李思耐等[31]、孙娅楠[32]证实,党参、生黄芪、丹参等QSTH的主要成分具有降低TAC术后心衰动物模型左心室室壁厚度、质量指数,改善LVEF,具有抑制心肌重构同时改善心室舒张收缩能力的作用。本实验结果显示在心肌胶原纤维化定量分析中,T3M组(QSTH+自噬阻滞药)术后2周时心肌细胞纤维化程度最低,但却表现出较重的心肌肥厚、炎性细胞浸润,这是因为而心肌成纤维细胞自噬是心肌纤维化的主要过程[33],自噬被抑制的同时,心肌纤维化也被抑制,该组术后4周时出现较明显的纤维化改变,提示芪参桃红颗粒可能具有促进自噬的作用;TR组(QSTH+自噬激动药)干预2周、4周时,心肌细胞纤维化显著,且术后4周,TR组心肌细胞纤维化水平并未显著高于M组,提示芪参桃红颗粒可能具有抑制自噬过度活跃的作用,且T组与E组都表现出胶原纤维比降低,据此进一步提示芪参桃红颗粒可能具备双向调节自噬通量的特点与抑制心衰小鼠心肌纤维化的作用。细胞凋亡的定量分析结果提示,过分自噬(TR组)以及抑制自噬的状态(T3M组)都会导致凋亡水平过高,而T组显著低于前2组,提示芪参桃红颗粒可以通过调节适应性自噬水平,降低心肌细胞凋亡百分比,并发挥保护心肌功能的作用。

当心肌细胞处于某种应激条件时,如持续的压力负荷、缺血缺氧等,细胞能量代谢发生障碍,促使细胞自噬异常,并将诸多信息整合转化为相关基因的表达异常,其中包括自噬相关miRNA表达异常。本实验miRNA测序及KEGG分析结果显示,M组相较于S组,新陈代谢通路、溶酶体通路与心肌细胞自噬联系紧密,并且富集性高、差异显著;T组较M组mTOR、溶酶体通路富集明显,与自噬密切相关。结合文献检索及以上实验结果可以发现,术后2周,T组较M组,miR-96-5p、miR-200c-3p、miR-200a-3p上调,支持了自噬水平被上调的可能性[34-35];术后4周时,miR-671-5p上调,支持了心肌组织自噬水平被下调[36-39],相应组织样本定量PCR验证了上述miRNA的差异性结果。

中医已有心衰病名,虽然其内涵却与现代心力衰竭综合征的内涵不完全一致,但HF患者动则气喘、气虚乏力、脉细弱或结代、口唇发绀的主要症状均被中医所认知、归纳,总结出“心悸”“支饮”“喘证”“心胀”“肾水”“心水”等病,可以与今天的临床症状对应。既往有学者发现,HF的基本病机是心气虚,贯穿疾病始终,并可伴随水停、血瘀等实证病机[40];在心气虚的基础上,病机可进一步发展为气阴两虚或阳虚,衍生诸多症状。芪参桃红颗粒针对HF核心病机所设,重在补心气,兼顾活血利水。本实验中,M组呈现显著的心力衰竭气虚血瘀证表现,如运动减弱、抓取反应力降低、皮毛光泽差、纳差;相对于假手术组,SLW显著增大,并可发现发现,少量运动即可导致急促的胸腹呼吸运动。此外可以明显发现,术后2、4周时,对各组动物眼球取血,M组剥离眼球后,血液滴速缓慢、血色暗淡、血量少且易凝,T组剥离眼球后,血流更快,血液贴壁流动性好,血液鲜红,出血量大,据此总结发现,气虚血瘀证显著存在于小鼠TAC心衰模型中,且芪参桃红颗粒活血效果明显;并且,根据SLW可以发现,M组显著高于S组与其他各组,全身血脉皆过于肺,心气虚时,心脏无力鼓动血行,气亦不能发挥气帅血行的功能,血停于脉中为淤血,故而脉道不通,水道不利,兼全身气虚,肺脾肾三脏气化失司,发为水饮停聚。肺具有通调水道的功能与朝百脉的特性,当水停于肺时,就可见小鼠动则喘息,伴肺脏体积增大、SLW升高。芪参桃红颗粒重在益气,兼顾活血利水,有效改善TAC心衰小鼠的心衰症状、病理表现、血液流动与SLW,这些结果印证上述理论在动物模型中的表现,并对本团队前期相关成果作了进一步的补充与论证。《血证论》说:“气为血之帅……气得之而静谧。”《张氏医通》说:“盖气与血……血不得气,则凝而不流。”可见,在血液运行,气血关系中,气具有主导作用,血的异常运行与气的病理变化密切相关,此外,《素问·痿论》亦强调:“心主身之血脉。”即心统帅全身血脉。以上理论再次强调了气血的密切联系,尤其是血液有赖于心气的推动,才能在脉中环流不息,发挥濡养周身的作用。虽然气血概念,古今有所区别,但古人对血液运行的观察,与现代无太多出入,都是血液循行脉中,停于脉中或流于脉外是为瘀血。

综合以上实验结果及分析,芪参桃红颗粒可以缓解压力负荷心衰小鼠的心肌重构并改善心功能;其机制可能是基于细胞自噬并调控相关miRNA,在心衰发生发展的过程中,芪参桃红颗粒可能上调或下调心肌细胞自噬水平趋向于某种特定程度,以产生相应的保护作用。本次实验并未进行自噬流及自噬关键蛋白检测,仅能通过相关miRNA推断芪参桃红颗粒对于自噬干预作用的趋势,但未得到直接的自噬趋势证据,下一步可以基于miRNA测序差异基因,检测目标蛋白的差异表达,并直接观测心肌细胞自噬流与线粒体自噬变化,进一步探究芪参桃红颗粒治疗心力衰竭的作用机制。

利益冲突声明:无。