高效液相色谱法指纹图谱结合化学模式识别的小金制剂质量研究

于密密 范妙璇 李 铮 陈有根 傅欣彤 郭洪祝

(北京市药品检验研究院/国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室/中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京,102206)

小金制剂(小金丸、小金片、小金胶囊)原名小金丹,出自《外科证治全生集》,由麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙和香墨组成,具有散结消肿、化瘀止痛的功效,用于阴疽初起、皮色不变、肿硬作痛、多发性脓肿、瘿瘤、瘰疬、乳岩、乳癖等,是临床治疗乳腺增生的首选药[1-2]。

中成药是中药复方制剂临床应用的主要形式,其质量优劣直接影响临床疗效。《中华人民共和国药典》2020年版规定了小金制剂的鉴别、双酯型生物碱限量和麝香酮含量测定等项目。但小金制剂作为中药复方,药味种类众多、组成复杂,包含贵细药、树脂树胶类药物、动物药、粪便类药物、植物药、矿物药,其中不少药物缺乏有效的质量控制方法,仅限定小金制剂双酯型生物碱含量、规定麝香酮含量的质量标准难以实现小金制剂的全面质量评价[3-5]。

指纹图谱具有整体性特点,可在整体上表征中药化学成分,是目前中药制剂质量一致性评价的有效手段之一[6-8]。指纹图谱结合化学模式识别的方式可以实现中药指纹图谱的降维、分类和综合分析,目前已应用于中药及中药制剂的质量评价[9-10]。不同厂家、同厂家不同批次间药品的质量一致性是确保临床疗效稳定可靠与临床试验结果可重复的重要前提[11-20],本研究抽取全国16个不同厂家47批小金制剂样品,采用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法建立小金制剂的指纹图谱,结合主成分分析、聚类分析、正交偏最小二乘分析方法,考察不同厂家、不同批次小金制剂的质量差异,为评价其产品的质量和质量一致性提供科学参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A型高液相色谱仪(日本岛津公司,日本,型号:LC-20A型);电子分析天平(赛多利斯科学仪器公司,型号:CP225D);Milli-Q级超纯水系统(默克股份有限公司,德国,型号:Advantage A10)。

1.2 试剂 甲醇为(色谱纯,美国默克公司supelco,批号:1150907120);水为超纯水;乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司,批号20190822)。藁本内酯(纯度100%,批号:111737-201810),麝香(批号:120982-200303)木鳖子(批号:121418-200501),草乌(批号:121338-201502),枫香脂(批号:121637-201201),没药(批号:120967-201706),五灵脂(批号:121348-201202),地龙(批号:120987-202109),乳香(批号:120970-201806),当归(批号:120927-201617),均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 分析样品 47批小金制剂包括小金丸(大蜜丸,水蜜丸,小蜜丸)、小金片、小金胶囊;其中小金丸购自14个厂家,共34批;小金胶囊购自2个厂家,共9批;小金片购自1个厂家,共4批,企业名称分别用A～Q代替。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(5 m,4.6 mm×250 mm);流动相为甲醇(A)-水(B),梯度洗脱,洗脱条件见表1;检测波长为310 nm;流速1.0 mL/min。

表1 指纹图谱梯度洗脱

2.2 对照药材溶液制备 取麝香0.14 g,木鳖子、草乌、枫香脂、没药、五灵脂、地龙各0.6 g,乳香、当归各0.3 g,香墨0.06 g,精密称定,精密加入乙醇25 mL,称定重量,超声处理45 min,取出,放冷,用乙醇补充减失重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得对照药材溶液。

2.3 供试品溶液制备 取小金丸/胶囊3.0 g、小金片2.0 g,精密称定,精密加入乙醇25 mL,称定重量,超声处理45 min,取出,放冷,用乙醇补充减失重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得供试品溶液。

2.4 药材阴性溶液制备 按制剂工艺及“2.3”供试品溶液制备方法分别制备麝香或人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙和香墨的阴性空白溶液。

2.5 精密度试验 取同一供试品溶液(编号D1),按照“2.1”项下色谱条件,连续进样6次,记录所得色谱图,6次数据之间的相似度在0.996～1.000之间,说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液(编号D1),分别于配制后0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h注入液相色谱仪,依法测定,6次进样数据的相似度均在0.996～1.000之间,说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批样品(编号D1)6份,按“2.3”项下供试品溶液制备方法平行操作,依法测定,所得图谱结果经指纹图谱相似度评价系统计算,6份样品相似度在0.995～0.999之间,说明重复性良好。

2.8 指纹图谱的建立 47批小金制剂样品按“2.3”项下方法制备成供试品溶液,吸取10 μL,注入液相色谱仪,测定。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2012)进行色谱峰匹配,共标定9个共有峰。将对照药材图谱和药材阴性图谱对比分析,根据各峰的保留时间,对所得的共有峰进行归属,1、7、8、9号峰主要来自枫香脂,2号峰主要来自麝香,3号峰藁本内酯来自当归,4号峰来自五灵脂中扁柏双黄酮,5、6号峰来自乳香。

2.9 指纹图谱相似度评价 将47批样品的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行峰匹配,生成对照指纹图谱。见图1。将47批次不同厂家的小金制剂(丸、片、胶囊)指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度评价。见表2。不同厂家的小金制剂及小金制剂各批次之间均具有一定的差异,个别厂家差异较大。见图2～3。

图1 小金制剂对照指纹图谱

图2 小金制剂丸(J42、J49、J27、J3、J9、J45)相似度低的指纹图谱

图3 小金制剂胶囊(J54、J8、J25)相似度低的指纹图谱

表2 小金制剂相似度检验结果

2.10 指纹图谱聚类分析 分析结果显示,当组距为10时,47批小金制剂可以分为3类,第一类包括16批,第二类包括25批,第三类包括6批。见图4。

图4 聚类分析树状图

2.11 指纹图谱主成分分析 以47批小金制剂指纹图谱中的9个共有峰为变量,运用SPSS 22.0数据处理软件对47批小金制剂指纹图谱进行主成分分析,根据特征值和贡献率选出主成分。见表3。以特征值>1为标准,提取出的主成分有3个,其累积贡献率为77.5%,包含了原有47批小金制剂指纹图谱的主要信息,矩阵结果见表4。第1主成分信息量最大,峰1、6、7在第1主成分中有明显的载荷值，峰3、4在第2主成分中有明显的载荷值，峰6、8在第3主成分中有明显的载荷值，利用SIMCA 14.1软件绘制主成分分析得分。由主成分分析得分图可知，47批小金制剂样品明显分布于3个区域，表明47批次小金制剂样品可以被分为3类。见图5。

表3 特征值与方差贡献率

表4 初始因子载荷矩阵

2.12 指纹图谱偏最小二乘判别分析 将47批小金制剂样品的9个共有峰面积导入SIMCA 14.1软件中,获得相应模型。见图6。根据模型中变量权重要性排序预测值来筛选具有统计意义的差异标志物,在0.95的置信区间内,选出变量权重要性排序>1.0的色谱峰为差异标志物,峰3、1、5、4的变量权重要性排序值分别为1.35、1.14、1.10、1.10,均大于1。

3 讨论

3.1 色谱条件优化 为了更全面的检测小金制剂中各类化学成分,采用二极管阵列检测器采集190～400 nm波长的色谱图,并串联蒸发光检测器进行同时检测。经分析比较多次实验结果发现,采用二极管阵列检测所得到的色谱峰的信息远远多于采用蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)检测所得到的结果;同时比较分析了不同检测波长下的色谱图,综合考察色谱峰数量、分离度等因素,最后以310 nm为指纹图谱检测波长。流动相组成考察了甲醇-水系统和乙腈-水系统。实验结果显示甲醇-水系统中各药味成分的色谱峰分离效果较好,且有较稳定的表现,最终确定采用甲醇-水系统。同时,对色谱柱类型进行了考察。比较了Phenomenex Luna C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)、Discovery C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)、Gemini 110A(5 μm,4.6 mm×250 mm)、CAPCELLPAK C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)等不同类型的色谱柱,结果显示采用Kromasil C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)进行分离时,色谱峰分离效果最好。故选用此色谱柱。

3.2 提取溶剂及提取方法的选择 分别采用50%乙醇、70%乙醇、乙醇、甲醇作为考察溶剂,以色谱峰数量、峰面积等因素为考察指标,结果显示,采用乙醇和甲醇作为提取溶剂时,色谱峰数量最多,峰面积较大。故选用乙醇提取。

3.3 主要色谱峰的分析 我们建立指纹图谱的过程中,尝试采用20多种对照品对共有峰进行指认并进行药材来源归属,采用化学模式进行识别分析,表明峰3、1、5、4可作为鉴别和区分小金制剂的质量标志物。指认了峰3和峰4,分别为来自当归的藁本内酯和来自五灵脂的扁柏双黄酮,尽管1,5号峰尚未进行指认,但确认了药味来源分别为枫香脂和乳香。来自于枫香脂的7、8、9号色谱峰,峰面积最大,对指纹图谱相似度的数据结果影响最大,均提示枫香脂可能是影响小金制剂质量差异的主要因素。对小金制剂的质量控制和评价仍然具有较强的意义。

3.4 数据分析 聚类分析是将收集到的数据归类的统计方法,通过聚类分析可以将所得数据进行归类,并从分类依据可以反映一类样本的主要特征。分析结果可知,同一厂家的同一剂型产品,聚类情况差异较大。有的厂家相同剂型的产品聚类较为集中,如J5、J17、18、J29、J30、J32、J33为来自同一厂家的丸剂,分别聚集在第一类和第三类,反映同一厂家、同一剂型不同批次产品,质量稳定性较好,但仍存在一定差异;此外,不同厂家生产的同一剂型产品,未呈现明显聚类趋势,如J5、J55、J32为源自不同厂家的丸剂,分别聚集在第一类、第二类和第三类,反映了不同厂家同一剂型的小金制剂产品质量存在较大差别。因此,寻找小金制剂的质量差异性成分,建立稳定、可靠的质量控制方法是非常必要的。

主成分分析能够将原有多个指标数据转化成一组新的相互无关的几个综合变量(主成分),全面反映原始多个数据的信息,能反映小金制剂的基本特征。载荷的绝对值越大,对主成分的贡献越大,表明影响小金制剂质量差异性的是多个成分,而不是单一成分。

为进一步寻找上述3类型批次之间产生的差异性主要标志物,采用偏最小二乘判别分析对小金制剂样品进行分析。更加准确地反映小金样品的成分差异,并通过VIP值筛选出其中的差异性化学成分,为后续的含量测定提供参考。

采用聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别分析化学模式识别分析方法,对小金制剂指纹图谱研究结果进行进一步统计分析。47批小金制剂样品分成了3类,并筛选出4个差异性质量标志物,作为小金制剂质量差异的指标。同一剂型的个别的厂家聚类不统一,说明小金制剂质量的差异性,可见建立稳定、可靠的质量控制方法是非常必要的。

3.5 质量评价 47批小金制剂指纹图谱相似度评价结果显示,不同厂家、不同批次的小金制剂相似度高于0.90占62%,说明小金制剂大部分一致性较好,个别批次个别厂家存在质量一致性问题。其中代码E、J、H、Q厂家指纹图谱和对照指纹图谱差异较大,相似度较低。从指纹图谱可以宏观地看出质量差的产品。部分同一生产企业不同批次的产品相似度也有较大差异,说明产品批间质量不均一,或存在投料不规范,药材质量差的问题。这些现象说明小金制剂在整体质量控制方面还存在一些不足。我们希望在现有标准的基础上,采用更为全面科学的、符合中药特点的质量控制与评价方法,来系统表征中药质量。最终服务于药品生产和质量评价和控制。也是中药药品质量发展的必然趋势。

利益冲突声明:无。