基于UPLC特征图谱的南、北葶苈子及其混伪品的鉴别研究△

周海琴，钱润，李松，陈盛君，胡剑虹，海丰，张开雪，查同乐

江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214434

葶苈子为十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.或独行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟种子，前者习称“南葶苈子”，后者习称“北葶苈子”[1]。南葶苈子主产于山东、河南、江苏、安徽、浙江等地，为目前市场主流品种；北葶苈子主产于河北、辽宁、内蒙古。葶苈子入药始载于《神农本草经》，名“亭历”，列为下品[2]。经考证，古代最早以十字花科独行菜L.apetalumWilld.为葶苈子的基原植物[3]，即为苦葶苈子；后葶苈子又有了甜、苦之分，甜葶苈子基原植物应为十字花科播娘蒿D.sophia（L.）Webb.ex Prantl.[4]，也有将菥蓂子、荠菜子等作甜葶苈子使用的记载。《汤液本草》云：“苦甜二味，主治不同。仲景泻肺汤用苦，余方或有用甜者，或有不言甜苦者。大抵苦则下泄，甜则少缓，量病人虚实用之，不可不审”[5]。可见苦、甜两种葶苈子在古代均可入药，只是功效略异。现代研究证明南、北葶苈子在化学成分、药理作用等方面有所不同，因此在临床应用上应区别使用[6]。由于各地用药习惯不同，以及同科属植物种子形态相似而导致误用或混用，造成葶苈子在全国的商品品种比较混乱，影响临床疗效[7]。

葶苈子及其混用品大多外形细小、形态类似，肉眼不易辨别，组织切片也有困难。本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立了南葶苈子、北葶苈子及其掺伪品菥蓂子、荠菜子的鉴别方法，为药材生产、采购、临床使用及质量控制提供参考。

1 材料

1.1 样品

南葶苈子购于山东、山西、河南、安徽等地，经鉴定为十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.的种子。北葶苈子采自河北省，经鉴定为独行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟种子。荠菜子采自安徽省、江苏省，经鉴定为十字花科荠Capsella bursa-pastoris（L.）Medic.的干燥成熟种子。菥蓂子采自广西、江西、安徽，经鉴定为十字花科菥蓂Thlaspi arvenseL.的干燥成熟种子。上述样品均由江阴天江药业有限公司唐波高级工程师鉴定，具体样品信息见表1。

表1 南、北葶苈子及其混伪品药材样品信息

1.2 试药

对照品槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷（批号：111854-201203，纯度：91.7%）、异槲皮苷（批号：111809-201804，纯度：92.9%）均购自中国食品药品检定研究院；芥子碱（批号：5389，纯度99.9%）购自上海诗丹德生物科技有限公司；异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（批号：PS010548，纯度：97.3%）购自成都普思生物科技有限公司；南葶苈子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121220-201403）；色谱纯乙腈（Thermo Fisher 公司）；色谱纯磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

ACQUIYT-UPLC-H-Class 型超高效液相色谱系统（Waters 公司）；1290 Infinity 型超高效液相色谱仪、G6530 Accurate-Mass Q-TOF 型质谱联用仪均购于Agilent 公司；XP6 型百万分之一天平、ME204E/02型万分之一电子分析天平均购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-250E 型超声清洗机（昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q 型超纯水系统（Millipore 公司）；TGL-16C 型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 南葶苈子药材特征图谱的建立

2.1.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～4 min，7%～10%A；4～11 min，10%～18%A；11～13 min，18%～23%A；13～18 min，23%～28%A；18～20 min，28%～45%A），流速为0.3 mL·min-1，柱温为35 ℃，检测波长为254 nm。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 参照物溶液的制备 取南葶苈子对照药材0.5 g，置具塞锥形瓶中，加水25 mL，加热回流60 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品适量，精密称定，加30%甲醇配制成质量浓度为21.641 μg·mL-1的对照品溶液。再取对照品芥子碱、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷适量，精密称定，分别加甲醇配制成质量浓度分别为51.349、50.761、61.727 μg· mL-1的混合对照品参照物溶液。

2.1.4 共有峰的确认 按上述方法测定19 批南葶苈子药材的UPLC 图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）对南葶苈子色谱图进行结果分析，以编号M1 样品的特征图谱为参照，进行多点校正和匹配，19 批南葶苈子药材特征图谱共标识出12个共有峰（图1），以平均数法生成南葶苈子药材对照特征图谱（图2），经质谱指认和对照品比对，确认2号峰为芥子碱、3号峰为槲皮素-3-Oβ-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷、11 号峰为异槲皮苷、12 号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（图3）。

图1 19批南葶苈子药材UPLC特征图谱叠加图

图2 南葶苈子药材对照特征图谱

图3 南葶苈子供试品溶液（M7）与对照品溶液的UPLC图

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 精密度试验 精密称定样品（M7），按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件连续进样6 次，每次1 μL，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷所对应的峰3 为参照峰S1，计算峰1～峰8的相对保留时间和相对峰面积；以异槲皮苷所对应的峰11为参照峰S2，计算峰9～峰12 的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.06%～0.56%，共有峰相对峰面积的RSD 为0.42%～1.80%，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.1.5.2 重复性试验 精密称定样品（M7），按2.1.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样1 μL，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷所对应的峰3 为参照峰S1，计算峰1～峰8 的相对保留时间和相对峰面积；以异槲皮苷所对应的峰11 为参照峰S2，计算峰9～峰12 的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD 为0.04%～0.64%，共有峰相对峰面积的RSD 为0.77%～2.28%，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.1.5.3 稳定性试验 精密称定样品（M7），按2.1.2项下方法制备供试品溶液，每隔4 h进样1次，每次进样1 μL，共测定24 h，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷所对应的峰3 为参照峰S1，计算峰1～峰8 的相对保留时间和相对峰面积；以异槲皮苷所对应的峰11为参照峰S2，计算峰9～峰12 的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～1.26%，共有峰相对峰面积的RSD为0.77%～2.37%，各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 均小于3%，表明24 h 内样品的稳定性较好。

2.1.5.4 中间精密度试验 精密称定样品（M7），分别由2 个实验员按2.1.2 项下方法各制备3 份供试品溶液，分别于不同时间、在不同仪器上（Waters UPLC 和Agilent 1290）分别进样1 µL，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷所对应的峰3为参照峰S1，计算峰1～峰8 的相对保留时间和相对峰面积；以异槲皮苷所对应的峰10为参照峰S2，计算峰9～峰12的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明中间精密度良好。

2.1.6 特征图谱建立 取19 批南葶苈子样品，按2.1.2 项下方法分别制备供试品溶液，分别按2.1.1项下色谱条件进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）进行结果分析，选择峰形和分离度较好、纯度较高的峰，确定12 个共有峰（图1），并生成南葶苈子药材对照特征图谱（图2），以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷所对应的峰3 为参照峰S1，以异槲皮苷所对应的峰11为参照峰S2。通过质谱指认及对照品色谱峰保留时间比对，共指认4个特征峰，峰2为芥子碱、峰3 为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷、峰11为异槲皮苷、峰12为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（图3）。计算19批南葶苈子特征图谱相对保留时间及相对峰面积。19 批样品中特征峰的保留时间比较稳定，RSD 均小于1%（表2）。峰面积比值浮动范围比较大，RSD 为7.44%～65.91%（表3），表明不同产地南葶苈子质量有一定差异。

表2 19批南葶苈子样品中特征峰的相对保留时间

表3 19批南葶苈子样品中特征峰的相对峰面积

2.2 葶苈子UPLC特征图谱的应用

将南葶苈子、北葶苈子及菥蓂子、荠菜子药材特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）分别生成对照特征图谱（图4～图6），再以南葶苈子对照图谱为对照，分别将其与北葶苈子、菥蓂子、荠菜子对照特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）进行对比分析。

图4 南葶苈子与北葶苈子药材特征图谱比较

2.2.1 南葶苈子与北葶苈子鉴别研究 南葶苈子与北葶苈子特征图谱对比结果表明，两种不同基原葶苈子药材的对照特征图谱具有较明显的区别（图4），主要差别在峰3 及峰13，经对照品指认，峰3 为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷。经质谱指认，峰13 为槲皮素-3-O-β-D-[6-O-芥子酰基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基]-葡萄糖苷。实验结果与文献报道一致，即峰3为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷，仅存在于南葶苈子中[8]。峰13 为槲皮素-3-O-β-D-[6-O-芥子酰基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基]-葡萄糖苷主要存在于北葶苈子中[9]。

2.2.2 南葶苈子与菥蓂子鉴别研究 南葶苈子药材与菥蓂子药材的对照特征图谱有较明显的区别（图5），主要差别在峰2、峰3、峰13、峰14 及峰15，峰2、峰3 主要存在于南葶苈子中，峰13、峰14、峰15 主要存在于菥蓂子中。经对照品指认峰2为芥子碱、峰3 为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷，经质谱指认峰13为异牡荆苷、峰15为当药黄素。

图5 南葶苈子与菥蓂子药材特征图谱比较

峰3（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷）在伪品菥蓂子中几乎检测不到，在南葶苈子中很高，因此，除特征图谱外，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量亦可作为南葶苈子与伪品菥蓂子的区分点。

2.2.3 南葶苈子与荠菜子鉴别研究 南葶苈子与荠菜子药材的对照特征图谱对比见图6，主要差别在峰6 与峰13，峰6 主要存在与南葶苈子中，峰13 主要存在于荠菜子中。经质谱指认峰6 为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷，峰13 有待进一步研究。

图6 南葶苈子与荠菜子药材特征图谱比较

上述建立的特征图谱方法不仅能够有效鉴别葶苈子药材的真伪，同时可以准确鉴定到南葶苈子、北葶苈子基原。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法考察和色谱条件优化

在供试品溶液的制备条件探索中，比较了不同提取溶剂（30%、50%、70%甲醇、纯甲醇和乙醇）对南葶苈子药材特征图谱的影响，结果发现，70%甲醇提取的色谱峰较多，故选择70%甲醇加热回流1 h 为最优提取方法。通过考察乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.3%磷酸水溶液为流动相体系进行梯度洗脱时，发现乙腈-0.3%磷酸水溶液作为流动相，各色谱峰分离度较好、峰形较佳、基线平稳；通过在210～400 nm 全波长扫描，比较各波长色谱图，发现在254 nm 处色谱峰响应值最佳，故选择254 nm 作为南葶苈子药材特征图谱的检测波长。

3.2 南葶苈子共有峰确定

本研究建立了南葶苈子药材UPLC 特征图谱方法，确定了12 个共有峰，能较好地代表南葶苈子整体质量；通过对照品指认，确定了4 个化合物，分别是芥子碱、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，并对6个化合物进行了质谱指认。

3.3 葶苈子多基原及混伪品鉴别

由于南葶苈子、北葶苈子及其混淆品菥蓂子、荠菜子形态细小，肉眼不易观察，曹海燕等[7]采用微性状对葶苈子及其混淆品进行区分，但此方法对实验人员的经验要求比较高，难以普及和推广，存在分辨率较低的缺点，尤其对多基原药材、品种混乱药材的鉴定较为困难。本研究建立南葶苈子药材的UPLC 特征图谱，并对南葶苈子、北葶苈子及其混伪品进行鉴别研究，研究显示，两种不同基原葶苈子及其混伪品菥蓂子、荠菜子药材的对照特征图谱具有较明显的区别，主要区别为：1）若被检测的样品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品相应保留时间处无色谱峰或色谱峰峰面积低于上述对照品的峰面积，在芥子碱对照品相应保留时间处无色谱峰或色谱峰峰面积低于上述对照品的峰面积，则被检测样品为菥蓂子；2）若被检测的样品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品相应保留时间处无色谱峰或色谱峰峰面积低于上述对照品的峰面积，在芥子碱对照品相应保留时间处存在色谱峰，则被检测样品为北葶苈子；3）若被检测的样品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品相应保留时间处存在色谱峰，在异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品相应保留时间处无色谱峰，则被检测样品为荠菜子；4）若被检测的样品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品相应保留时间处存在色谱峰，在异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品相应保留时间处存在色谱峰，则被检测样品为南葶苈子。

本研究采用UPLC 特征图谱比较南葶苈子、北葶苈子及其混伪品菥蓂子、荠菜子的特征峰的差异，不仅能对多基原进行快速准确鉴别，而且能够鉴别市场易混淆品。所采用的色谱条件重复性好、易于控制，结果直观可靠，方法简便易行、快速有效，可为南葶苈子、北葶苈子及其混伪品菥蓂子、荠菜子的鉴别提供依据。