肝细胞癌患者超声造影特征与其血浆miR-30a 水平的相关性研究

路 英，王 霞

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国常见的肝脏恶性原发肿瘤，复发率高[1]。尽管近年来多种治疗手段的提高在一定程度上提高了患者的预后，但疾病的死亡率仍然较高，因此如何评估患者预后至关重要。 肝脏超声造影检查具有操作简单、重复性高等优点，可用于评估肝癌诊断、进展及治疗效果等[2]。miR-30a 是与HCC 密切相关的microRNAs （mi RNAs），研究发现[3～5]，miR-30a 肝癌组织中低表达，可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，提示其在HCC 发生发展过程中发挥重要作用。 如何利用超声造影方法间接分析HCC 的预后因子， 并寻找它们之间的相关性是研究的热点。 笔者对HCC 患者进行了超声造影检查及外周血miR-30a 水平检测， 并探索两者关系，希望为HCC 预后评估提供新方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料

研究采用双盲法。 选择2019 年1 月至2021 年8月在新疆医科大学第二附属医院手术治疗的100 例HCC 患者（HCC 组），其中男性74 例，女性26 例；年龄32 ～78 岁，平均年龄58.24 岁（标准差4.92 岁）；肿瘤数量，1 个67 例，≥2 个23 例；直径3.1 cm（标准差0.23 cm）。

选择标准： ①符合《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》[6]，病理、实验室指标等明确诊断；②均首次治疗，术前无放化疗；③临床资料完整；④患者及家属知情同意，医院伦理委员会批准。

排除标准：①合并肝脏其他疾病；②合并其他组织器官肿瘤；③严重心肝肾功能不全者；④血液、免疫系统疾病。

选取同期50 例健康人群（对照组），其中男性35例，女性15 例；年龄30 ～71 岁，平均年龄56.24 岁（标准差12.32 岁）。

选择标准：①肝肾功能正常；②均获得知情同意。

排除标准：组织器官肿瘤者。

两组性别、 年龄比较， 差异无统计学意义 （P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 超声检查

采用美国Philips 公司EPIQ7 彩色多普勒超声仪（中国江苏）进行检查，探头频率3.5 ～5.0 MHz。 使用Bracco 公司研制的SonoVue 造影剂。 患者仰卧于检查床，对肝脏常规检查，包括肿瘤位置、大小、数量、边界、内部回声、血流信号及周围组织结构。 用0.9%氯化钠溶液（生理盐水）溶解SonoVue，混匀后由肘部静脉注入，再用0.9 %氯化钠溶液（生理盐水）冲管，记录4 min 内肿瘤内部增强及消退特征。 将结果进行时间-强度曲线分析，记录始增时间、达峰时间、峰值加速时间、始增速度及增强速度。

1.2.2 逆转录聚合酶链式反应检测血浆miR-30a 表达

所有患者的血样在入院后24 h 内采集， 对照组血样在登记时采集。 所有血样在4 °C、1 600 g 条件下离心10 min。 随后，将上清液转移到Eppendorf 管中，于4°C、12 000 g 条件下离心10 min。 保留血浆并储存在-80°C 冰箱中。 采用实时定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测miR-30a 在血浆中的含量。 使用PureZOL RNA分离试剂（Bio-Rad）从血浆中提取总RNA。 使用RTPCR Quick Master Mix（Toyobo）进行cDNA 的反转录。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo）进行qPCR，miR-30a 的相对表达量使用2-ΔΔCt表示，内参为U6。

引物序列：miR-30a 上游序列，5′-ACACACTCCAGCTGGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游序列，5′-TGTCGTGGAGTCGGAATTC-3′；U6 上游序列，5′-CTCGCTTCGGAGCACATACTA-3′，下游序列，5′-ACGAATTTGTGTCATCCTGC-3′。

根据miR-30a 中位数将患者分为低表达组和高表达组。

1.2.3 观察指标

HCC 病灶及癌旁组织超声造影特征；HCC 组及对照组血浆miR-30a 水平；miR-30a 表达水平与超声造影特征的关系。

1.3 统计学方法

使用SPSS 24.0 软件（IBM）进行统计分析，并使用GraphPad Prism7.01 软件绘制图。 使用分位数图（Q-Q 图）检查连续变量的正态性，正态或近似正态分布计量资料用均值± 标准差表示，两组间采用t检验比较。P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌与癌旁组织超声造影特征比较

HCC 病灶的始增时间、达峰时间、峰值加速时间均低于癌旁组织，始增速度和增强速率均高于癌旁组织（均P＜0.05）。 见图1、表1。

表1 HCC 与癌旁组织超声造影指标比较Tab.1 Comparison of contrast-enhanced ultrasound indexes between HCC and adjacent tissues

图1 HCC 典型超声造影图像Fig.1 Typical contrast-enhanced ultrasound images of HCC

2.2 肝细胞癌患者与健康人血浆miR-30a 水平比较

HCC 组患者血浆miR-30a 水平（0.12±0.03）低于对照组（0.28±0.04），差异有显著统计学意义（t=7.945，P=0.000）。

2.3 不同miR-30a 表达水平患者超声造影特征

根据miR-30a 中位数将患者分为低表达组（43例）和高表达组（57 例）。 低表达组患者始增时间、达峰时间、 峰值加速时间均低于高表达组， 始增速度和增强速率均高于高表达组（均P＜0.05）。 见表2。

表2 不同miR-30a 表达水平患者超声造影特征比较Tab.2 Comparison of contrast-enhanced ultrasound features in patients with different miR-30a expression levels

3 讨论

HCC 是消化系统常见恶性肿瘤之一，预后差。 肿瘤组织内大量新生血管为肿瘤的生长供给了丰富营养，因此全方位评估肿瘤内部血液供应情况及肿瘤细胞增殖调控机制， 不但可以用于评价疾病严重程度，还可以为其临床治疗提供新的方法和思路。

超声造影检查是近年来新型发展的超声检查技术，通过对患者的局部病灶部位血管造影，进而对患者的血流情况进行分析，为患者的病理状态及恶性生物学能力进行评估[7～9]。 原发性肝癌的生长发育主要以浸润性生长为主，所以在病理学中，生长发育过程中需要大量养分，血管较为丰富，容易对周边组织造成压迫。超声造影通过将造影剂注射到病灶局部血管内，分析病灶血流情况，从而对病灶病理状态进行评估。始增时间与病灶区域血管的通畅性及血管压力有关，峰值时间与病灶区血管通畅性及侧支循环能力有关。 有文献报道[10]，HCC 分化程度越低，造影增强消退越快。 冉琪等研究同样发现[11]，HCC 超声造影参数与肿瘤病理特征、 患者预后有关。 笔者研究结果显示，HCC 区域始增时间、达峰时间、峰值加速时间均低于正常肝组织， 始增速度和增强速率均高于癌旁组织，提示HCC 组织内新生血管丰富，管径粗、阻力小，造影剂进入血管的速度更快，与刘轼初等[12]研究结果一致，如HCC 病灶的始增时间、达峰时间、峰值加速时间均小于病灶周围背景肝组织，病灶始增速度和增强速率均大于病灶周围背景肝组织。随着肿瘤细胞增殖能力的增加，对营养的需求逐渐增加，导致肿瘤内部新生血管数量增加，血管畸形率升高，在超声造影特征上表现为肿瘤区域内部血流量增加、流速升高。 此外，HCC 组织内存在大量动静脉短路， 导致肿瘤内血流量增大，流速增快。

miRNAs 是一类长度约为18 ～25 nt 的非编码调控RNA， 在肿瘤恶性生物学行为中发挥重要作用。miR-30a 是最近发现的一种miRNAs， 在多种肿瘤组织中低表达，与肿瘤细胞的恶性生物学行为有关[13～15]。有文献报道[16]，过表达miR-30a 可促进肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。 另外研究发现[17]，miR-30a 在肝癌组织中低表达，与肿瘤分期、分化程度及预后有关。笔者研究结果显示，HCC 患者血浆miR-30a 水平低于健康人群，这与Yang X 等[17]研究结果基本一致，进一步佐证了miR-30a 在HCC 发生发展中的作用。 超声造影可以对病灶内部血流情况进行定量分析，真实评估病灶血流状态。肿瘤内部丰富血流可促进细胞增殖，而肿瘤细胞增殖受miR-30a 调控。但HCC 超声造影参数与miR-30a 表达水平的关系是否相关目前尚不清楚。笔者研究结果显示，低表达组患者始增时间、达峰时间、峰值加速时间均低于高表达组，始增速度和增强速率均高于高表达组， 提示HCC 肿瘤组织的血流状态与miR-30a 表达调控有关，随着HCC 肿瘤组织内血供增多， 流速增快，miR-30a 表达水平也增加，进而导致肿瘤细胞恶性行为。

综上所述， 超声造影可以准确评估HCC 肿瘤组织血流状态， 其血流参数与miR-30a 表达水平有关，可为间接反映miR-30a 水平提供新思路。