用DNA 宏条形码技术分析鹄沼枝额虫的食性

陈江，吴俣学，王艳艳，姚俊杰，何浩宇

（1.贵州大学渔业资源与环境研究中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州省农业科学院水产研究所，贵州 贵阳 550025）

食性分析是摄食生态学（trophic ecology）的主要内容之一和动物个体及种群研究的基础。目前，食性分析的方法主要有胃内容物分析法、稳定同位素法和直接观察法。在鱼类等水生动物食性研究中，主要采取胃内容物形态学鉴定分析法[1,2]，但已被消化的碎屑食物、糜等无法镜检观察判断种类[3]。小型水生动物摄食量小、肠内容物分离困难，形态学的鉴定就更加困难[4]。

DNA 宏条形码（DNA metabarcoding）技术是2012 年由Taberlet 等[5]研究提出，能更有效地分析胃内容物，已广泛运用于土壤和水生态环境的多样性监测[6,7]、微生物菌群研究[8,9]、陆生动物食性[10]和生物监测[11]等。在水生动物中，已开始利用宏条形码技术来研究海蜇（Rhopilema esculentum）、塔型马蹄螺（Tectus pyramis）、黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）等的食性[12-14]。

仙女虾（fairy shrimp）是一种淡水小型甲壳动物，是无甲目（Anostraca）一类动物的统称，是甲壳纲动物中最具多样性的分类单元[15]。仙女虾的大部分物种是滤食性动物[16,17]，极少数仙女虾是捕食者[18]。2021 年9 月30 日，在贵州省都匀市甲登村一个池塘发现有仙女虾，经鉴定为鹄沼枝额虫（Branchinella kugenumaensis），隶属于钗额虫科（Thamnocephalidae）枝额虫属（Branchinella）。鹄沼枝额虫主要分布于中国、日本、朝鲜及印度南部，为淡水仙女虾。潘茜等研究了饵料对鹄沼枝额虫生长和生殖力的影响。他们提到鹄沼枝额虫主要以细菌、有机碎屑和单胞藻等为食，用豆腐、虾片、米糠、大豆、面粉、小球藻6 种饵料培养鹄沼枝额虫幼体[19]。鹄沼枝额虫通过产生休眠卵来度过不利时期，条件适宜时，大量生长、繁衍[20]。鹄沼枝额虫出现时间和地点不确定，对其在自然界中的食性了解较少。本研究采用DNA 宏条形码技术研究了鹄沼枝额虫的食性，以进一步认识其摄食特点。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在贵州省都匀市甲登村的一个池塘（E107°44'46.74"，N26°17'55.36"）采集鹄沼枝额虫样品。虫体质量（0.032±0.004）g，全长（15.93±1.81）mm。

用灭菌后的器具在解剖镜下快速取肠道放入无菌管中，用无水乙醇固定，然后放入装有干冰的低温盒。共采集50 尾鹄沼枝额虫肠道，带回实验室后，-80 ℃保存。

1.2 DNA 提取、文库构建和测序

使用OMEGA 的E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 试剂盒提取鹄沼枝额虫宏基因组DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性，Qubit 定量检测DNA 样本浓度，质检合格后，将提取的DNA 用Covaris S220 聚焦超声仪进行剪切、回收，质检合格后，使用NEB NextUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 试剂盒进行文库扩建。测序以及部分数据分析由上海生工生物工程公司完成。

1.3 宏基因组拼接组装、预测和物种注释

将质量控制后的读长用IDBA_UD 软件拼接组装成长序列contig，根据读长间的overlap 关系，获得contigs。使用Prodigal 软件对组装后的contigs 的开放式阅读框进行预测。采用CD-HIT 软件进行聚类，每类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集。使用DIAMOND 软件将基因集蛋白序列与Nr 数据库进行blastp 同源性比对，得到同源物种信息。根据NCBI 的微生物分类学信息数据库，在界、门、纲、目、科、属和种水平注释物种信息。统计分析时，动物统计序列相对量在0.1%以上的物种，考虑到水体中藻类的因素，植物统计序列相对量在0.001%以上的物种。

2 结果与分析

2.1 样品测序数据质控结果

样品测序数据质控结果见表1。对鹄沼枝额虫样品进行高通量测序，共获得有效序列61 146 906条，平均序列长度138.54 bp。碱基质量在Q30 以上的比列为93.52%，GC 碱基数目3 517 923 616 bp。

表1 样品测序数据质控结果Tab.1 Quality control results of sample sequencing data

2.2 鹄沼枝额虫的食物种类

鹄沼枝额虫食物组成中各门的物种数见表2。在除去鹄沼枝额虫自身序列、无法鉴定且数量较少的序列后，共获得151 个物种，分属于10 个门类:节肢动物门（Arthropoda）、刺胞动物门（Cnidaria）、脊索动物门（Chordata）、线虫动物门（Nematoda）、软体动物门（Mollusca）、半索动物门（Hemichordata）、环节动物门（Annelida）、扁形动物门（Platyhelminthes）、被子植物门（Angiospermae）和绿藻门（Chlorophyta）。食物序列最丰富的类群是节肢动物门，共有83 种，其次是脊索动物门和被子植物门，分别有27 种和14种，最少的是环节动物门和半索动物门，分别是2种和1 种。

表2 鹄沼枝额虫食物各门物种数Tab.2 Number of species in the food items of fairy shrimp B.kugenumaensis in phylum level

鹄沼枝额虫主要食性物种组成见表3。鹄沼枝额虫主要的食性物种来自四个门：节肢动物门、刺胞动物门、脊索动物门和半索动物门，共有19 个物种。在纲水平，昆虫纲有12 个物种，甲壳纲、蛛形纲各有2 个物种，水螅纲、鸟纲和肠鳃纲均只有1 个物种。

表3 鹄沼枝额虫主要食性物种组成Tab.3 Species composition of food items in fairy shrimp B.kugenumaensis

从门水平上来看（图1），节肢动物门占据了食物序列总数的70%，脊索动物门占11%，刺胞动物门占5%，软体动物门占4%，线虫动物门占4%，半索动物门占2%。植物所占食物序列的比例少，被子植物门0.7%、绿藻门0.3%。

图1 鹄沼枝额虫门水平上食物组成比例Fig.1 Food composition of fairy shrimp B.kugenumaensis at phylum level

在属水平上（图2），溞属（Daphnia）占食物序列比例最高，为12%，其中大型溞（D.magna）占7%，蚤状溞（D.pulex）占5%。其次是水螅属（Hydra）占据食物序列的5%，其中Hydra littoralis 占据0.9%，水螅（Hydra vulgaris）占据4%。顶切叶蚁属，占据食物序列的4%，物种为顶切叶蚁（Acromyrmex echinatior）。弓背蚁属（Harpegnathos）占据食物序列的4%，物种为跳镰猛蚁（Harpegnathos saltator）；镰猛蚁属（Camponotus）占据食物序列的3%，物种为佛罗里达弓背蚁（Camponotus floridanus），毛蚁属（Lasius）占据食物序列的1%，物种为黑毛蚁（Lasius niger）。斑蝶属（Danaus）、长吻虫属（Saccoglossus）和鸽属（Columba）占据食物序列的3%，均只有一个物种，分别为黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）、Saccoglossus kowalevskii 和原鸽（Columba livia）。

图2 鹄沼枝额虫属水平上食物组成比例（取相对含量前十五的属）Fig.2 Food composition of fairy shrimp B.kugenumaensis at genus level

3 讨论

3.1 鹄沼枝额虫食性分析

饲喂实验和胃肠内容物分析发现，大部分仙女虾物种过滤水体中的有机颗粒来生存[16,17]，但不清楚有机颗粒的物种组成。本研究运用DNA 宏条形码技术，了解了鹄沼枝额虫在自然水域中的滤食信息。鹄沼枝额虫因体型差异、生活环境等因素的影响，无法捕食节肢动物门、脊索动物门、软体动物门等门类的个体较大的动物，但检测结果中这几个门类的动物占据了70%DNA 序列，这表明鹄沼枝额虫是滤食水体中这些门类动物的有机碎屑。

本研究观察到，鹄沼枝额虫以仰泳的形式游泳，头部和腹面朝上，腹部附肢拨水游动。Cannon 在阐述仙女虾的摄食机制时认为，食物颗粒是被一股明确的力带向口腔，鹄沼枝额虫的摄食是主动过滤[16]。从形态学来看，鹄沼枝额虫的唇是头部在额附肢下方的延续，大致呈三角形，向后延伸，边缘周围有稠密的刚毛，外唇腺突出；下颌骨在口器的两侧，呈棒状，前端有细小的齿和较大的棘；上颌骨较小，无节，边缘具17～18 双节羽状刚毛[20]。鹄沼枝额虫的口器上下都具有刚毛，有利于鹄沼枝额虫过滤水体中的有机颗粒。鹄沼枝额虫的齿和棘的可将较大的食物颗粒切碎。本研究结果中大型蚤体长在1.75～6.00 mm，蚤状溞体长在0.91～3.36 mm。鹄沼枝额虫个体较大，可用齿和棘切碎后进入肠道。

鹄沼枝额虫是主动滤食。从食物组成中发现，动物成分占据了99%，植物成分只占0.9%，是否说明鹄沼枝额虫的食物组成是以动物蛋白为主呢？有关研究表明，仙女虾的滤食无选择性，即各种动植物死后在水中降解为有机碎屑被其随机滤食[21]。鹄沼枝额虫也同样如此，它通过叶足运动来摄食，对于环境中的有机碎屑无法选择，均被其滤食。食物成分的动物与植物的占比，只能说明该水体中动物有机碎屑量远远高于植物有机碎屑量。

3.2 DNA 宏条形码技术鉴定小型水生动物食性物种的优势

在DNA 宏条形码技术出现以前，对仙女虾等小型水生动物的食性研究大多采用饲喂实验、胃肠内容物分析方法[17,22-24]。如Brendonck 将一种仙女虾（S.proboscideus）养殖在不同密度海藻细胞的悬浮液中，观察其滤过率和摄食率[23]；Metens 等[24]用纤毛虫、轮虫、团藻、线虫和小型甲壳动物作为食物喂养S.proboscideus 研究其食性和摄食机制；Bernice分析了另一种仙女虾（Spreptocephlas dichotomus）肠道内容物，发现了浮游动植物和甲壳动物碎片，认为浮游植物是S.dichotomus 的主要食物来源，也认为它的滤食无选择[22]。这些研究工作多在实验室进行，相对于复杂自然水体，实验室条件可控；胃肠内容物分析虽然可以观察到野外仙女虾的部分食物种类，但对“甲壳动物碎片”、滤食有机颗粒和已消化或半消化食物，则难以通过形态学鉴定。

DNA 宏条形码技术的发展，为小型水生动物的食性研究提供了极大的便利。本研究中，对鹄沼枝额虫整个肠道的测序准确地定性分析了野生鹄沼枝额虫滤食有机碎屑的食物物种组成，这是饲喂实验、胃肠内容物分析等方法难以获得的结果。DNA宏条形码技术在食性分析中具有对饵料生物的分辨率和准确性高，可以分析已经被消化的饵料生物，在水生动物食性分析中将发挥重要作用。

小结

采样DNA 宏条形码技术鉴定了自然水域中鹄沼枝额的食性。共鉴定出10 个门的151 个物种，获得了大量具体食物物种的信息。研究表明，在自然水体中，鹄沼枝额虫的食物来源与其出现的水体环境密切相关，其获取食物的方式是主动滤食，食物种类无选择性，但可以用齿和棘切碎个体较大的大型蚤和蚤状溞。

在以后的研究中，期望在更多不同的水体获得鹄沼枝额虫，测定与分析食性，获得更多、更全面地对鹄沼枝额虫食性的深入认识。