颗粒蛋白前体在儿童免疫性血小板减少症中的应用价值*

石 磊,景春梅,刘 茜,王 偲

(重庆医科大学附属儿童医院检验科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿科学重庆市重点实验室,重庆 400014)

免疫性血小板减少症(ITP)是一种儿童常见的出血性疾病,其以外周血血小板减少为主要特点。临床表现为皮肤及黏膜瘀点、瘀斑,脏器出血等,主要发病机制为免疫介导的血小板破坏增多、骨髓巨核细胞成熟障碍导致血小板产生不足[1]。儿童ITP大多数是一种良性自限性疾病,为排他性诊断,目前,尚无特异性指标可确诊ITP。部分再生障碍性贫血(AA)患儿早期也可仅表现为血小板降低,红系和粒系两系下降不明显或正常,与ITP的外周血血常规检测结果很难鉴别,易被误诊为ITP[2]。ITP和AA的鉴别诊断主要依靠骨髓穿刺检查,但由于不同部位造血能力不同,穿刺部位及阅片技术等因素均可能影响骨髓检查结果[3]。此外,骨髓穿刺检查是侵袭性操作,对血小板计数(Plt)明显降低、出血倾向严重者也存在一定风险。ITP与AA的发病机制和治疗均存在明显区别,因此,早期鉴别诊断对及早进行不同的治疗方案具有重要意义。本研究探索一种简便的辅助检查方法,旨在为ITP和AA的有效鉴别诊断提供参考依据。

颗粒蛋白前体(PGRN)是一种能在外周血检测的自分泌生长因子,表达于上皮细胞、吞噬细胞、造血细胞、免疫细胞等,是一种重要的免疫调控因子。据文献报道,PGRN参与了多种感染性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病的发生、发展[4-8]。YU等[9]对大于14岁ITP患者的研究结果显示,与健康者及非免疫性血小板减少患者比较,ITP患者血浆PGRN水平显著升高。但目前尚少见关于儿童ITP血清PGRN水平的相关文献报道。因此,推测PGRN可能是儿童ITP的一种有价值的新型生物标志物。本研究检测了儿童ITP血清PGRN水平,探索了PGRN对儿童ITP的诊断,以及与AA的鉴别诊断价值。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2021年7月至2022年12月本院收治的初诊儿童ITP患儿 60例(ITP组)、AA患儿45例(AA组),以及健康儿童45例(健康对照组)作为研究对象。ITP诊断标准符合《中国儿童原发性免疫性血小板减少症诊断与治疗改编指南(2021版)》[10]：(1)至少2次血常规检测Plt减少;(2)脾脏一般无增大;(3)骨髓涂片检查显示巨核细胞总数增多或正常伴有成熟障碍;(4)排除其他继发性血小板减少症。AA诊断标准符合《儿童再生障碍性贫血诊疗规范(2019年版)》[11]：(1)血常规检查红细胞、粒细胞和血小板减少,校正后的网织红细胞小于1%;(2)骨髓穿刺检查示有核细胞增生程度活跃或减低,骨髓小粒造血细胞减少,非造血细胞比例增高,红系、粒系、巨核系三系明显减少;(3)骨髓活检显示有核细胞增生减低,巨核细胞减少或缺如等;(4)排除先天性和其他获得性骨髓造血衰竭疾病。ITP组和AA组患儿采血检测前均未接受过输血、化疗和刺激造血治疗等。本研究经本院医学研究伦理委员会审批通过(2019-114)。

1.2方法

1.2.1标本采集与检测 采集3组研究对象静脉血2 mL于乙二胺四乙酸二钾紫色抗凝管中,室温放置,6 h内采用日本Sysmex XE-2100血细胞分析仪进行血常规检测,记录Plt和平均血小板体积(MPV)。检测试剂及质控品均为原装配套试剂,每天检测前做好室内质控。对Plt减少的标本均采用重新检测和血液涂片瑞氏染色镜检的方式复检。同时,采集3 mL静脉血于促凝管中,3 000 g离心6 min后收集血清,-80 ℃保存。血清PGRN测定使用Human Progranulin Quantikine ELISA kit(R&D systems,Minneapolis,MI,USA),严格按说明书操作。

1.2.2治疗及随访 对10例ITP患儿使用静脉注射免疫球蛋白[0.8～1.0 g/(kg·d)]1～2 d后随访检测血清PGRN水平变化。

2 结 果

2.13组研究对象一般资料比较 ITP组患儿中男39例,女21例;中位年龄33.5个月;AA组患儿中男23例,女22例;中位年龄89.0个月;健康对照组研究对象中男28例,女17例;中位年龄40.5个月。3组研究对象Plt、MPV及血清PGRN水平比较见表1。ITP患儿测出MPV 5例,AA患者测出MPV 20例。

表1 3组研究对象Plt、MPV及血清PGRN水平比较

2.23组研究对象PGRN水平比较 ITP组患儿血清PGRN水平[91.04(66.40,126.39)ng/mL]明显高于AA组[61.05(48.36,75.25)ng/mL]及健康对照组[59.54(48.33,63.21)ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05) 。见图1。

注：与ITP组比较,aP<0.05。

2.3ITP患儿治疗前后PGRN水平比较 ITP患儿使用静脉注射免疫球蛋白治疗后血清PGRN水平[(93.19±26.51)ng/mL]明显低于治疗前[(122.28±40.70)ng/mL],差异有统计学意义(P<0.05) 。见图2。

注：与治疗前比较,aP<0.05。

2.4PGRN鉴别健康儿童与ITP、ITP与AA的诊断效能 当PGRN临界值为71.85 ng/mL时鉴别诊断ITP与健康儿童的AUC为0.903,灵敏度为66.7%,特异度为97.8%;当PGRN临界值为86.45 ng/mL时鉴别诊断ITP与AA的AUC为0.826,灵敏度为53.3%,特异度为97.8%。见图3、4。

图3 PGRN鉴别儿童ITP与健康儿童的ROC曲线

图4 PGRN鉴别儿童ITP与AA的ROC曲线

3 讨 论

儿童ITP是儿童期发生的一种获得性、免疫性疾病,常表现为皮肤及黏膜瘀点、瘀斑,以外周血血小板减少为主要特点,其发病机制尚未完全明确。骨髓涂片检查表现为巨核细胞总数增多或正常,伴有成熟障碍。目前,ITP主要是进行排除性诊断,结合临床症状和实验室检查结果进行临床确诊。AA是一种骨髓衰竭性疾病,骨髓造血功能低下,主要与自身免疫破坏、造血微环境功能缺陷及造血干细胞内在缺陷等有关。儿童ITP诊断需排除血小板生成减少类疾病所致的血小板减少,如AA、急性白血病等,目前,主要通过骨髓穿刺涂片鉴别。但骨髓穿刺检查为有创性检查,相关指南不建议对具有典型表现的ITP患儿进行骨髓穿刺,需根据病情开展血常规、生化、免疫指标等常规检查[12]。本研究探索一种外周血中的生物标志物帮助提高ITP和AA的鉴别诊断,以最大限度地避免不必要的骨髓穿刺检查。

PGRN广泛表达于骨骼肌、上皮细胞、巨噬细胞等多种组织和细胞[7],其在肿瘤、炎症及维持和调节正常组织增殖、再生、修复和机体防御反应方面均发挥着重要作用。PGRN具有抑炎和促炎双重作用,与其所在的微环境中炎症介质和炎症部位之间的竞争有关。在调控机制方面PGRN还能促进调节性T淋巴细胞(Treg)的分化和功能,抑制效应T淋巴细胞的活化及增殖。

以往文献报道,PGRN在大于14岁的ITP患者血浆中明显升高,通过ITP动物模型证实了PGRN具有促进血小板升高的作用,在ITP中具有保护性调控作用;发现PGRN基因的缺失会导致动物脾脏细胞中Treg比例下降,提示PGRN可能通过调控Treg数目参与了ITP的病理生理过程[9]。儿童与成人ITP由于感染、免疫、环境及基因因素不同,其临床表现、治疗反应也存在差异[13]。

本研究结果显示,ITP患儿血清PGRN水平明显高于健康对照组,与成人ITP的研究结果一致[9],提示PGRN参与了儿童ITP的发生、发展过程。本研究中随访了10例ITP患儿接受静脉注射免疫球蛋白治疗后血清PGRN水平明显下降,进一步提示PGRN参与了儿童ITP的发生、发展过程。在今后的研究中将结合患儿体内其他细胞因子变化进一步探讨PGRN在儿童ITP中发展的机制。

本研究进一步探讨了PGRN在儿童ITP的变化和用于鉴别诊断AA的价值。通过ROC曲线分析了PGRN的诊断效能,当PGRN临界值为71.85 ng/mL时鉴别诊断ITP与健康儿童的AUC为0.903;当PGRN临界值为86.45 ng/mL时鉴别诊断ITP与AA的AUC为0.826。

ITP发病机制复杂,缺少灵敏且独特的检测标志物。关于血小板参数,如MPV、血小板分布宽度(PDW)、大血小板比率(PLCR)、未成熟血小板分数(IPF)等,鉴别ITP与其他疾病已有相关文献报道。NEGASH等[14]发现,检测MPV、PDW、PLCR等有助于预测血小板减少患者是ITP或低增生性血小板减少,MPV、PLCR用于鉴别ITP与低增生性血小板减少时的AUC分别为0.876和0.816。KHAN等[15]研究表明,MPV、PDW、PLCR用于初诊ITP时灵敏度和特异度均较低,不能作为一个较好的筛查工具。因为在临床工作中当血标本Plt较低时血细胞分析仪常无法测出MPV、PDW等参数,这些病例的血小板参数就无法获得。本研究中ITP组和AA组均有部分病例MPV、PDW等参数未能测出。IPF用于鉴别ITP与健康儿童及骨髓衰竭性疾病时也有不同的研究结果,美国一项对儿童的研究表明,IPF能较好地鉴别诊断ITP与骨髓衰竭性疾病,并能识别出血风险增加的患者[16]。巴西学者发现,IPF在健康组和ITP组中也存在明显差异[17]。德国学者用2种血液分析仪测定了IPF用于鉴别ITP与骨髓衰竭性疾病,其中一种仪器具有较好的鉴别能力,另一种仪器则无预测价值。其假设这或许是因为ITP和骨髓衰竭性疾病中存在未成熟血小板重叠的生物现象,现在还不能靠改进的技术方法完全解决[18]。本研究结果表明,血清PGRN水平可作为鉴别ITP与健康儿童、AA的一个可靠指标。

本研究也存在一定局限性：(1)本研究为单中心研究,今后期待纳入更多中心的病例进行研究;(2)未对纳入病例进行足够时间的随访,未能明确PGRN水平是否与儿童ITP患儿的预后及病程长短相关,将是下一步研究的方向;(3)本研究只纳入了ITP和AA,在今后的工作中将研究PGRN用于鉴别ITP与遗传性血小板疾病、原发性免疫缺陷[19]及其他容易混淆的引起儿童血小板减少的疾病。

总之,儿童ITP患儿血清PGRN水平升高,且PGRN可作为鉴别儿童ITP与健康儿童、AA的一个较好的指标。