黄芪甲苷调控外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN通路抗结直肠癌肝转移机制研究

李 玲，季 青，周 晶

上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科/肿瘤研究室（上海 201203）

结直肠癌（colorectal cancer）是目前最常见的恶性肿瘤，在世界范围内发病率居第3位（10.0%），病死率居第2 位（9.4%），并且发病率和病死率在中国呈上升趋势［1］。转移是造成结直肠癌难治性的重要原因。肝脏是结直肠癌患者最常见的转移部位。15%～25%的结直肠癌患者在初诊时即诊断为结直肠癌肝转移，8%～13%的原位结直肠癌患者在手术治疗后出现肝转移［2］。伴有肝转移的结直肠癌患者5年生存率为3.3%，显著低于原位结直肠癌患者的90.3%［1］。因此，结直肠癌肝转移是影响结直肠癌治疗效果和预后评价的重点和难点。Jumonji 结构域包含蛋白3（JMJD3）作为组蛋白甲基化修饰的关键酶，通过特异性去除第27 位赖氨酸三甲基化的组蛋白H3（H3K27me3）甲基化修饰，调控基因转录，进而影响结直肠癌的发生发展［3］。骨桥蛋白（OPN）是肿瘤相关巨噬细胞激活的关键标记物，与结直肠癌的不良预后相关［4］。外泌体作为肿瘤细胞的信使，其携带的各种细胞因子和蛋白质在细胞与微环境之间的通信中起关键作用，为肿瘤细胞的生存和生长提供合适的环境。外泌体通过激活巨噬细胞促进抑制性免疫微环境的形成，这是结直肠癌肝转移的重要机制之一［5］。

近年来，通过中药干预肿瘤源性外泌体，进而改善肿瘤治疗效果的实验研究不断出现，这也从微观的角度证明了中药对肿瘤源性外泌体的影响是确切的［6-7］。脾虚湿热是结直肠癌的核心中医病机，脾虚是导致结直肠癌肝转移的关键环节［8］。黄芪作为健脾益气中药，临床中运用广泛。现代药理学研究［9-11］发现，黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，ASⅣ）作为黄芪主要药理活性成分，具有调节免疫和抗肿瘤的作用，在肝癌、肠癌、胃癌等肿瘤的治疗中运用广泛。课题组前期研究发现［12-13］，ASⅣ能够通过影响外泌体介导的肿瘤相关巨噬细胞激活抑制结直肠癌肝转移，但具体机制尚不明确。本研究以组蛋白甲基化为切入点，探究ASⅣ调控肿瘤相关巨噬细胞激活的内在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 小鼠结直肠癌细胞株MC38，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 动物 6 周龄SPF 级C57BL/6J 小鼠15 只，雄性，体质量15～20 g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物生产许可证号：SYXK（沪）2020-0009。所有小鼠全程饲养于上海中医药大学实验动物中心，12 h/12 h 明暗周期，自由摄取食水。动物使用许可证号：SCXK（沪）2022-0004。本实验由上海中医药大学伦理委员会批准（伦理批准号：PZSHUTCM2212270002），所有实验符合实验动物伦理学要求。适应性饲养1 周后开始正式实验。

1.1.3 药物与试剂 ASⅣ（纯度＞98%），上海源叶生物科技有限公司（批号：B20564）；Dulbecco 改良的 Eagle（DMEM）培养基、0.25%的胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液，美国Corning公司（批号分别为10-013-CV、25-053-CI、30-002-CI）；胎牛血清，美国Gibico 公司（批号：10099-141）；乙二胺（Cy3）标记山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG，H+L）、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（H+L）、免疫染色封闭液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号分别为A0516、A0423、P0102、A0208、P0010）；凝胶快速制备试剂盒，上海雅酶生物医药科技有限公司（批号：PG212）；预染彩虹蛋白标记，美国Thermo Fisher Scientific 公司（批号：26616）；化学发光液，德国Merck Millipore 公司（批号：WBKLS0500）；RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司（批号分别为RC112、R312、Q331）；抗体JMJD3、H3K27me3、OPN 及成熟小鼠巨噬细胞标志物（F4/80）、甘露糖受体（CD206）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），美国CST 公司（批号分别为457S、9733T、88742S、30325T、24595S、92310SF）。

1.1.4 主要仪器 双人垂直流超净工作台，新加坡ESCO 公司（型号：SVE-6A1）；台式低速离心机，德国Eppendorf 公司（型号：5702R）；PCR 仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司（型号：7500）；激光扫描共聚焦显微镜，德国Leica公司（型号：Leica SP-8）；微型超速离心机，日本Hitachi株式会社（型号：CS120FNX）；纳米颗粒跟踪分析仪，英国Malvern 公司（型号：NS300）；恒温恒湿细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific 公司（型号：51033575）；化学发光成像仪，上海勤翔科技有限公司（型号：Chemiscope 6000）；酶标仪，美国Biotek 公司（型号：Synergy H1）；电泳仪及转膜仪，美国Bio-Rad 公司（型号分别为Power Pac HV、Trans-blot SD）；组织研磨仪，上海净信实业发展有限公司（型号：Tissuelyser-96）。

1.2 细胞实验

1.2.1 细胞培养及药物干预 MC38 细胞接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM 培养基中。待细胞铺满培养瓶90%时以0.25%胰蛋白酶消化后传代，传代比例1∶3，传至第3 代后用于正式实验。实验组为对照组、ASⅣ组。对照组常规培养。基于课题组前期研究［12］基础，ASⅣ组以25 μmol/L ASⅣ加入DMEM培养基配置成条件培养基继续培养。培养48 h 后分别收集细胞培养上清至50 mL 离心管，-80 ℃保存。所有细胞均培养于5% CO2、37 ℃、50 %～70 %饱和湿度细胞培养箱中。

1.2.2 外泌体提取 采用差速离心法提取外泌体。从-80 ℃冰箱中取出收集的细胞培养上清，4 ℃解冻后离心。4 ℃、800 r/min 离心10 min，取上清，去除细胞及碎片；4 ℃、4 000 r/min 离心 10 min，取上清；0.22 μm 滤器过滤后，4 ℃、240 000 r/min离心 30 min，取上清；将离心后上清转移至超离管内，4 ℃、240 000 r/min 超速离心70 min，弃上清，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀；4 ℃、240 000 r/min超速离心 70 min，弃上清，沉淀即为外泌体。加入适量 PBS 重悬外泌体，-80 ℃保存备用。使用前采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。对照组细胞培养上清提取的外泌体命名为MC38-EVs，ASⅣ组细胞培养上清提取的外泌体命名为ASⅣ/MC38-EVs。

1.2.3 外泌体鉴定 取10 μL 外泌体悬液，稀释10 倍后采用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径大小及浓度。

1.3 动物实验

1.3.1 分组与造模 C57BL/6J 小鼠15 只，按照随机数字表法分为模型组、MC38-EVs 组、ASⅣ/MC38-EVs 组，每组5 只。参考Lin 等［14］造模方法，构建小鼠结直肠癌原位肝转移模型，以皮下移植瘤作为瘤源，将肿瘤组织放置在无菌质量分数为0.9%的氯化钠溶液中，剔除出血及坏死组织，分割成若干直径约 1 mm 大小的组织块备用。1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔内注射麻醉。取下腹正中切口，长约 1 cm，逐层切开皮肤、腹膜，进入腹腔，钳出盲肠，于盲肠末端用眼科剪轻轻划破浆膜面，用医用胶将瘤体粘到盲肠末端，将盲肠回纳入腹腔，逐层关腹。小鼠结直肠癌原位肝转移模型构建方法见图1。

图1 小鼠结直肠癌原位肝转移模型构建

1.3.2 干预方法 模型组，每只小鼠尾静脉注射PBS，100 μL/次，隔日1 次，造模前1 周开始，连续3 周。MC38-EVs 组，每只小鼠尾静脉注射0.1 g/L 的MC38-EVs，100 μL/次，隔日1 次，造模前1 周开始，连续3 周。ASⅣ/MC38-EVs 组，每只小鼠尾静脉注射0.1 g/L 的ASⅣ/MC38-EVs，100 μL/次，隔日1 次，造模前1 周开始，连续3周。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 肝转移灶数目 小鼠结直肠癌原位肝转移模型构建4周后，剥取小鼠肝脏组织，观察肝转移灶数目并记录。

1.4.2 肝转移灶病理学变化 采用苏木精-伊红（HE）染色法观察肝转移灶病理学变化。取小鼠肝转移灶并置于4%多聚甲醛中固定15 min，100%、95%、85%、75%乙醇中依次梯度脱水3 min。二甲苯透明后常规浸蜡包埋；固定于切片机，切成5～8 μm 厚度的薄片。苏木精水溶液染色5 min，流水冲洗后，酸水及氨水各分色30 s，流水浸泡返蓝5 min，70 %及90 %乙醇脱水10 min，伊红染色5 min，流水冲洗后，无水乙醇脱水2 min，二甲苯透明5 min。透明后的切片快速风干，加拿大树胶封片，镜检。

1.4.3 蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN 蛋白表达 各组小鼠分别切取20 mg 的转移瘤组织置于1.5 mL EP 管中，每管加入300 μL蛋白裂解液，置于组织研磨仪中研磨匀浆。冰上裂解10 min 后，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，得到肝转移瘤组织蛋白。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺蛋白电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，相应一抗JMJD3、H3K27me3、OPN、GAPDH 均以1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜，Tris缓冲液洗涤后，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗杂交，比例1∶5 000。等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤后，ECL发光液浸泡1 min 后显影。ImageJ 软件检测每组JMJD3、H3K27me3、OPN、GAPDH灰度值，以GAPDH为内参，每组相对表达量以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值计算。

1.4.4 免疫荧光法检测肝转移灶中F4/80、CD206、JMJD3、H3K27me3、OPN 蛋白表达 取小鼠肝转移灶，常规脱水包埋后，冰冻切片10 μm，切片置于0.1 mol/L枸橼酸液中进行抗原修复；山羊血清室温封闭1 h，PBS清洗后，加入相应一抗稀释液（比例1∶500），4 ℃孵育过夜；PBS 清洗后，荧光二抗室温避光孵育1 h；PBS 清洗后，4',6-二脒基-2 苯基吲哚避光孵育15 min；PBS 清洗后滴加抗荧光淬灭剂封片。全自动数字玻片扫描仪扫片，ImageJ 软件分析平均荧光强度，检测肝转移灶中相关蛋白表达。

1.4.5 RT-qPCR法检测肝转移灶中JMJD3、OPNmRNA表达 各组小鼠分别切取10 mg 的转移瘤组织，加入350 μL 裂解液，冰上匀浆至无明显组织团块。按照RNA 提取试剂盒说明书提取组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，按RT-qPCR 试剂盒说明书进行mRNA 荧光定量。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，引物序列见表1。以GAPDH为内参基因，采用 2-ΔΔCt法分析各组相关mRNA表达水平。

表1 引物序列

1.5 统计学方法 采用 GraphPad Prism 9.0、SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析与作图。计量资料以表示。实验数据进行正态性和方差齐性检验，若数据符合正态分布，多组间差异比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间差异比较采用LSD检验；不符合正态分布或方差不齐的数据，其多组间差异比较采用Kruskal-Wallis 检验，两组间差异比较采用Games-Howell 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对结直肠癌肝转移灶的影响 通过分离小鼠肝脏，观察肝脏转移情况，进行肝转移灶计数和肝脏称重，并对肝脏进行HE染色。结果显示，与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显增加（P＜0.05）；与MC38-EVs 组比较，ASⅣ/MC38-EVs 组肝转移灶数目和肝脏质量明显减少（P＜0.05）。见图2、图3、表2。

表2 各组小鼠肝转移灶数目和质量比较（n=5，±s）

表2 各组小鼠肝转移灶数目和质量比较（n=5，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与MC38-EVs组比较，#P＜0.05。

组别模型组MC38-EVs 组ASⅣ/MC38-EVs组肝脏质量/mg 944.74±74.34 1 443.80±277.84*793.08±125.30#肝转移灶数目/个3.80±0.83 12.40±2.70*4.60±0.89#

图2 各组小鼠结直肠癌肝转移灶解剖图

图3 各组小鼠肝转移灶形态结构比较

2.2 对肿瘤相关巨噬细胞F4/80、CD206 蛋白的影响与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶中F4/80+、CD206+巨噬细胞数目明显增多（P＜0.05）。与MC38-EVs 组比较，ASⅣ/MC38-EVs 组肝转移灶中F4/80+、CD206+巨噬细胞数目明显减少（P＜0.05）。见图4。

图4 各组肝转移灶中CD206、F4/80蛋白表达水平比较（免疫荧光染色，×200）

2.3 对肿瘤相关巨噬细胞OPN 蛋白的影响 与模型组比较，MC38-EVs 组肝转移灶中OPN 表达显著升高（P＜0.05）。与MC38-EVs 组比较，ASⅣ/MC38-EVs 组肝转移灶中OPN 表达显著降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组肝转移灶中OPN蛋白表达水平比较（免疫荧光染色，×150）

2.4 对JMJD3/H3K27me3/OPN通路的影响 Western blot、免疫荧光实验结果显示：与模型组比较，MC38-EVs 组肝转移灶中JMJD3、OPN 蛋白表达水平升高，H3K27me3 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与MC38-EVs组比较，ASⅣ/MC38-EVs 组肝转移灶JMJD3、OPN 蛋白表达水平降低，H3K27me3 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见表3、图6、图7。

表3 各组肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达水平比较（n=5，±s）

表3 各组肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达水平比较（n=5，±s）

注：GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，JMJD3 为Jumonji 结构域包含蛋白3，H3K27me3 为第27 位的赖氨酸三甲基化的组蛋白H3，OPN 为骨桥蛋白。与模型组比较，*P＜0.05；与MC38-EVs组比较，#P＜0.05。

组别模型组MC38-EVs组ASⅣ/MC38-EVs组JMJD3/GAPDH 1.00±0.00 1.42±0.07*0.74±0.14#H3K27me3/GAPDH 1.00±0.00 0.49±0.05*1.32±0.16#OPN/GAPDH 1.00±0.00 1.56±0.10*1.23±0.10#

图6 各组肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN 蛋白电泳条带图

图7 各组肝转移灶中JMJD3、H3K27me3蛋白表达水平比较（免疫荧光染色，×150）

RT-qPCR实验结果显示，与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶中JMJD3、OPNmRNA 表达水平升高（P＜0.05）；与MC38-EVs组比较，ASⅣ/MC38-EVs组肝转移灶JMJD3、OPNmRNA表达水平降低，（P＜0.05）。见表4。

表4 各组肝转移灶中JMJD3、OPN mRNA 表达水平比较（n=5，±s）

表4 各组肝转移灶中JMJD3、OPN mRNA 表达水平比较（n=5，±s）

注：JMJD3 为组蛋白去甲基化酶基因，OPN 为人骨桥蛋白基因。与模型组比较，*P＜0.05；与MC38-EVs组比较，#P＜0.05。

OPN 2.02±0.37 14.41±1.07*1.21±0.11#组别模型组MC38-EVs组ASⅣ/MC38-EVs组JMJD3 1.21±0.04 4.54±0.83*1.19±0.55#

3 讨论

手术切除肝转移灶是结直肠癌肝转移的主要治疗方式，也是最有效的治疗手段。但临床证据表明，仅不到25%的患者达到手术切除指征，并且手术后遗症、药物不良反应等问题严重影响患者的生存质量［14］。在防治结直肠癌复发转移中，中西医结合治疗模式展现出显著优势。研究［15-19］显示，中医药在“整体观念”和“治未病”的理论指导下，可有效改善手术、放射治疗、化学疗法、靶向治疗和免疫治疗引起的不良反应，延长患者生存时间。中医认为正气亏虚是结直肠癌发生的根本原因，也是结直肠癌转移的基础。黄芪作为经典扶正药材，有补中益气、健脾利水之功，广泛应用于肿瘤治疗。经现代药理学研究［20］证实，黄芪主要通过提升患者的免疫功能从而发挥抗肿瘤作用。

ASⅣ是黄芪的主要单体活性物质，也是评价黄芪发挥药效的物质基础。ASⅣ具有抗炎、抗癌、抗氧化、调节免疫和调节代谢等多方面的药理作用［20-22］。研究［23-26］发现，ASⅣ在抗癌方面具有较大潜力，且抑癌效果广谱，对胃癌、肝癌、结直肠癌、宫颈癌等多种癌症具有抑制作用。体内动物实验研究［27］表明，ASⅣ直接灌胃给药能剂量依赖性抑制结直肠癌的生长和转移。与顺铂联用可显著增强结直肠癌的化学疗法敏感性［28］。本研究证实，ASⅣ能够通过调控肿瘤外泌体抑制结直肠癌肝转移。

H3K27me3是一种基因沉默性表观遗传学标记，影响基因的转录与翻译，与肿瘤的发生发展显著相关。JMJD3 是一种组蛋白去甲基化酶，属于Jumonji C 结构域包含基因家族，通常在结直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤等癌症中高表达，与不良预后相关［29］。JMJD3 通过以序列特异性的方式对H3K27me3进行去甲基化，影响染色质松紧结构，进而解除转录抑制，使其成为转录激活蛋白［3］。研究［30］发现，结直肠癌中，JMJD3 通过解除H3K27me3对E-钙黏蛋白、紧密连接蛋白-1和紧密连接蛋白-7 等基因的转录抑制，促进结直肠癌发展。同时，JMJD3 与巨噬细胞激活关系密切，其具体机制在于活化的JMJD3 通过促进H3K27me3 去甲基化促进精氨酸酶1、白介素-10、抵抗素样α等相关基因的表达，促进巨噬细胞M2 表型改变［31］。本研究证实，JMJD3 能够通过H3K27me3 影响OPN 活性调控巨噬细胞表型，ASⅣ能够调控JMJD3介导的H3K27me3/OPN通路。

OPN 是一种新发现的肿瘤相关巨噬细胞标记物，在结直肠癌的肝转移灶巨噬细胞中显著高表达［4］，然而有关巨噬细胞中OPN 表达水平具体的调控机制仍不清楚。本研究显示，肿瘤来源外泌体可以促进巨噬细胞JMJD3、OPN 蛋白表达，抑制H3K27me3 蛋白表达，提示JMJD3 在结直肠癌转移前微环境的形成中充分发挥其去甲基化酶的作用，降低H3K27me3 甲基化水平，促进OPN 转录，使巨噬细胞向肿瘤相关巨噬细胞表型转变，即影响JMJD3/H3K27me3/OPN通路可能是肿瘤外泌体影响结直肠癌肝转移的重要机制。ASⅣ作用后，肝转移灶数目减少，巨噬细胞JMJD3、OPN 蛋白表达显著降低，H3K27me3 蛋白表达升高，提示ASⅣ抑制结直肠癌肝转移的机制与JMJD3/H3K27me3/OPN通路有关。

综上所述，本研究发现ASⅣ能够抑制结直肠癌肝转移，减少肿瘤相关巨噬细胞激活。并结合体内实验进一步探讨了ASⅣ抗结直肠癌肝转移的作用机制，发现ASⅣ可能通过影响外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN 信号通路减少肿瘤相关巨噬细胞激活，进而抑制结直肠癌肝转移，发挥抗肿瘤作用。本研究为阐明ASⅣ抗结直肠癌肝转移分子机制提供了重要的理论依据，也可为深入研究中药抗肿瘤的药理作用提供参考。