硼替佐米联合PLK1抑制剂处理肿瘤细胞A549、HeLa对其增殖影响

胡 玲,王 英,蒋斌元,胡锦跃

(1. 重庆医科大学附属永川医院,重庆 402160;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154000;3.南华大学附属长沙中心医院,湖南 长沙 410004)

世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据中预估了全球185个国家36种癌症类型的最新发病率、死亡率情况,以及癌症发展趋势。数据显示,2020年全球新发癌症病例1 929万例,其中男性1006万例,女性923万例;2020年全球癌症死亡病例996万例,其中男性553万例,女性443万例[1]。

Polo样激酶(polo-like kinases, PLKs)是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族,参与细胞凋亡周期进展、中心粒的复制、有丝分裂、细胞凋亡动力学以及DNA损伤反应的调节[2]。抑制PLKs功能会导致细胞周期阻止停滞于G2/M期,进而诱导细胞凋亡[3]。PLK1高表达于快速增殖的组织,特别是基因组不稳定的肿瘤组织,PLK1被认为是癌症治疗的靶点之一[4]。目前,已有多种针对恶性肿瘤治疗的PLK1抑制剂在进行临床II-Ⅲ期试验[5-6]。

硼替佐米(bortezomib,PS341) 是一种可逆性和选择性的蛋白酶体抑制剂,通过靶向苏氨酸残基有效抑制20S蛋白酶体(Ki=0.6 nm),抑制蛋白酶体的功能会扰乱蛋白代谢导致泛素化蛋白的快速积累,当代谢压力无法修复将导致细胞凋亡的发生。PS341在治疗血液肿瘤方面取得了巨大的成就,研究者们对其治疗实体瘤方面的表现同样关注并进行了大量的探索[7]。

不同药理机制的小分子化合物联合使用是一种提高抗肿瘤药物的治疗效果的化疗策略[8],我们在探索PLK1抑制剂与蛋白酶体抑制剂联合使用时发现PLK1抑制剂与低浓度PS341共同处理肿瘤细胞A549、HeLa后,PLK1抑制剂对肿瘤增殖抑制的效果明显减弱,提示PLK1抑制剂与PS341的联合使用可能需要注意药物浓度等相关细节。因此,本研究针对此现象开展了以下实验,旨在明确PS341削弱PLK1抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制,探索相关的分子机制,为相关药物的临床推广和应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料PLK1抑制剂GW843682X、BI2536、蛋白酶体抑制剂PS341购买自美国MCE (MedChemExpress)公司,CCK-8试剂购自索莱宝科技有限公司,PI、RNAse购买嘉美生物技术有限公司,胎牛血清(FBS)购买自杭州四季青生物公司、DMEM培养基购自美国Hyclone公司,0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、链霉素、青霉素购自美国Biological Iudustries公司,PLK1抗体、兔二抗体购自美国 Cell signaling technology公司, Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK1、GAPDH、鼠二抗均购自碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养宫颈癌细胞HeLa和肺癌细胞A549购自美国ATCC。细胞用含1%双抗和10% FBS的DMEM培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞进行后续的实验。

1.3 实验分组PLK1抑制剂对肿瘤的增殖影响实验分11组:阴性对照(NC)组,GW843682X(GW)组(0.1、0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1)及BI2536(BI)组(10、25、50、75、100 nmol·L-1)。

PS341(PS)对PLK1抑制剂诱导肿瘤细胞抑制的影响实验13组:阴性对照(NC)组、GW 1 μmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 10 nmol·L-1、 GW 1 μmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 30 nmol·L-1, GW 1 μmol·L-1+PS 50 nmol·L-1、 GW 1 μmol·L-1+PS 100 nmol·L-1、BI 100nmol·L-1、BI 100nmol·L-1+PS10 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、BI100 nmol·L-1+PS 30 nmol·L-1、BI100 nmol·L-1+PS 50 nmol·L-1、BI100 nmol·L-1+ PS 100 nmol·L-1。

细胞形态学及蛋白免疫印迹实验分6组:分别为NC、PS 20 nmol·L-1、 GW1 μmol·L-1、 GW 1 μmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 20 nmol·L-1。

细胞周期检测实验分为10组:分别为NC、PS 20 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 10 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 30 nmol·L-1,、BI 100 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 10 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 30 nmol·L-1。

1.4 CCK-8检测细胞活性收集对数生长期的A549、HeLa细胞,调整细胞浓度为5×107L-1,每孔100 μL接种于96孔板中,37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养过夜。将NC组细胞培养液更换为完全培养基,实验组更换含对应药物的培养液继续培养。48 h后,去上清,每孔加入 90 μL DMEM培养基和 10 μL CCK-8试剂,37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内孵育1 h后,酶标仪(BioTek)测定波长为450 nm的吸光度(A)值,平行重复3次。

1.5 细胞形态学变化使用倒置光学显微镜(Leica)观察拍摄PS341对PLK1抑制剂诱导A549、HeLa细胞形态学变化的影响。

1.6 流式细胞术检测细胞周期的变化制备A549、HeLa细胞悬液,分别在12孔板每孔接种5×105个细胞,贴壁后,按照实验分组加入含有对应药物的混合培基,24 h后收集细胞,用PI染色法检测细胞周期。具体步骤为:消化细胞,PBS洗2遍,细胞用300 μL的PBS吹匀,再加入700 μL的已预冷的无水乙醇,4 ℃固定过夜,PBS洗2遍,加入PI 5 μL,RNase A 2 μL,轻轻混匀,室温避光30 min,上流式细胞仪(BD Accuri C6)检测。平行重复3次。

1.7 蛋白免疫印迹实验细胞接种于24孔板中,按照“1.3”分组处理24 h,收集细胞,用裂解液裂解收集蛋白。SDS-PAGE电泳后转PVDF膜,BSA室温封闭1 h,加入一抗、4 ℃过夜,二抗室温1.5 h,加入发光液显影,蛋白条带进行扫描与分析。

2 结果

2.1 PLK1抑制剂对肿瘤的抑制作用采用CCK-8方法检测PLK1抑制剂GW843682X、BI2536不同浓度处理A549细胞、HeLa细胞48 h后的细胞存活情况。与NC组相比,GW843682X在浓度0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1时明显抑制A549细胞的增殖(Fig 1A),BI2536在浓度10、25、50、75、100 nmol·L-1时明显抑制A549细胞的增殖(Fig 1A);与NC组相比,GW843682X在浓度0. 5、0.75、1 μmol·L-1时明显抑制HeLa细胞的增殖(Fig 1B),BI2536在浓度25、50、75、100时明显抑制A549细胞的增殖(Fig 1B)。为后续研究的目的,我们将GW843682X处理细胞浓度定在1 μmol·L-1,BI2536处理细胞浓度定在100 nmol·L-1,保证PLK1抑制剂的对细胞的抑制效果。

2.2 PS341对PLK1抑制剂诱导肿瘤细胞抑制率的影响A549、HeLa细胞采用GW、BI单独处理以及联合不同浓度的PS341处理48 h之后, CCK-8结果发现(Fig 2),与GW 1 μmol·L-1组的OD值相比, 20 nmol·L-1PS341和1 μmol·L-1GW组合处理组的OD值明显增加,BI组结果与GW组结果一致,表明PLK1抑制剂联合低浓度PS341处理对肿瘤的增殖抑制有明显削弱的影响。

Fig 1 Effect of PLK1 inhibitors on proliferation of A549 and HeLa cells

2.3 PS341对PLK1抑制剂诱导肿瘤细胞形态学的影响为了解PS341对PLK1抑制剂诱导A549、HeLa细胞形态学变化的影响,采用倒置光学显微镜观察(Fig 3A)。结果发现与空白组比较,GW 1 μmol·L-1以及BI 100 nmol·L-1处理A549、HeLa细胞,24 h后观察,细胞变圆贴壁性减弱,不完全贴壁细胞增加,然而联合20 nmol·L-1的PS341的实验组,贴壁细胞明显增多(Fig 3B,C)。

2.4 PS341对PLK1抑制剂诱导肿瘤细胞细胞周期阻滞的影响采用流式细胞术测试分组处理A549、HeLa细胞24 h后,细胞周期变化情况(Fig 4A-D),结果表示,与NC组比较,GW 1 μmol·L-1与BI 100 nmol·L-1组,细胞阻滞在G2/M期的数目大幅增加;与GW 1 μmol·L-1组,BI 100 nmol·L-1组相比,GW/BI联合PS341实验组G2/M期阻滞数目明显下降,其中联合PS341 20 nmol·L-1效果最明显,P<0.01(Fig 4E,F);表明低浓度PS341具有逆转PLK1抑制剂诱导肿瘤细胞。

2.5 PS341对PLK1抑制剂诱导肿瘤细胞周期蛋白的变化细胞的复制增殖与细胞周期密切相关,Cyclin家族蛋白是参与调控细胞周期的主要蛋白[9],Cyclin A在S期交界处含量到最大值,稳定维持到G2期,进入有丝分裂中期时迅速被蛋白酶体降解[10], Cyclin B从G1晚期开始表达积累,到G2期后期达到最大值并维持到M期中期,然后降解。CDK1/Cyclin B复合物是G2/M期过渡的主要调节因子,在M期具有最大活性[11]。Cyclin D 作为G1到S期转变的关键调节因子,在细胞周期中持续表达,Cyclin D1的过表达会导致肿瘤的产生[12]。Cyclin E则在M期的晚期开始表达并逐渐积累,G1晚期含量达到最大值,随后的泛素依赖性降解有助于S期的有序进展,在G2晚期其含量降到最小值[13]。各组药物处理A549和HeLa细胞24 h后,Western blot检测细胞周期蛋白的表达水平,结果显示(Fig 5):PS341的加入上调CyclinE1,下调Cyclin A2、CDK1、CyclinD1和PLK1。

Fig 2 Effect of PS341 on tumor cell inhibition induced by PLK1 inhibitor

3 讨论

肿瘤细胞中PLK1活性增加,抑制PLK1可诱导细胞周期阻滞抑制增殖,进而触发细胞凋亡,是抗肿瘤药物开发的靶点之一。BI2536、GW843682X是一类ATP竞争性的PLK1抑制剂, 与PLK1的激酶结构域结合并抑制其活性,扰乱有丝分裂进程,导致异常染色体的形成及细胞周期紊乱[14-15]。本研究发现,有效浓度的BI2536和GW843682X可诱导细胞周期阻滞于G2/M期,且抑制肿瘤细胞增殖的效果呈剂量依赖性,但与低浓度PS341联合使用后对肿瘤增殖的抑制大幅削弱,具体机制还有待探索。

Fig 3 Effect of PS341 on tumor cell morphology induced by PLK1 inhibitor

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白代谢的关键机制,可清除未折叠和错误折叠的蛋白质实现细胞内稳态,过度抑制泛素-蛋白酶系统可诱发严重的蛋白代谢障碍并导致细胞凋亡。以泛素-蛋白酶体系统为靶点治疗恶性肿瘤的小分子抑制剂一直受到研究者的关注,PS341是第一个也是最成功的治疗多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤的临床主要用药,主要是通过引起细胞周期阻滞和细胞凋亡而产生抗肿瘤作用[16],其在实体瘤中应用的相关探索也一直在进行。

我们最初为了探索不同分子机制药物的联合使用,将PLK1抑制剂和蛋白酶体抑制剂PS341组合进行了初步尝试,发现低浓度PS341明显削弱了PLK1抑制剂对A549细胞、HeLa细胞的增殖抑制及周期阻止效果,提示PLK1抑制剂与蛋白酶体抑制剂的联合使用可能存在药效减弱的风险。为探索相关分子机制,我们将研究目标锁定在细胞周期相关蛋白及细胞周期依赖性激酶,检测后发现加入PS341可明显增加Cyclin E1的表达,且PS341处理细胞后G1期细胞明显增加。鉴于Cyclin E1可在G1进入S期的阶段发挥功能且Cyclin E1的表达增加会导致肿瘤细胞的恶性进展[13], 我们推测Cyclin E1的异常累积是引起肿瘤细胞抵抗PLK1抑制剂的主要原因,并计划开展后续研究。

综上所述,低浓度的PS341对PLK1抑制剂有拮抗作用,导致PLK1抑制剂诱导的肿瘤细胞G2/M期阻滞减少,抑制增殖能力减弱,我们认为PLK1抑制剂与低浓度蛋白酶体抑制剂联合应用时可能会降低疗效,并建议两者的治疗应用可能需要考虑PLK1抑制剂药效减弱的风险。

Fig 4 Effect of PS341 on tumor cell cycle induced by PLK1 inhibitors detected by flow cytometry

Fig 5 Effect of PS341 on tumor cyclin induced by