红景天苷对LPS诱导的脑内炎症反应的抑制作用机制研究

周彬彬,郑雪蕊,谢志扬,余正双,吴青青,吴慧玲,赖文芳,洪桂祝

(福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)

中枢神经系统中的神经炎症是神经免疫学研究的重要课题。新出现的证据表明,神经炎症是各种神经系统疾病的关键因素,包括神经退行性疾病和中枢神经系统损伤[1-3]。

红景天为景天科红景天属多年生草本植物,生长在海拔1 800～2 700 m高寒无污染地带,具有很强的生命力和特殊的适应性,是我国珍贵的传统中药。根据医书古籍记载,红景天具有益气活血,通脉平喘的功能,主治气虚血瘀,胸痹心痛,中风偏瘫,倦怠气喘。其中红景天苷(salidroside,sal )为红景天属植物的共有成分,也是红景天的主要有效成分及其在《中国药典》规定的含量测定指标成分[3-4],课题组前期研究[5-7]sal能够穿透血脑屏障,对大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠具有较宽的治疗时间窗,能够降低脑梗死体积,改善神经功能损伤[8-9],这与sal的抗炎作用密切相关。且目前针对sal对中枢神经系统炎症反应的研究较少,因此本文主要通过研究sal对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脑内炎症反应的抑制作用,进一步探讨其作用机制,为sal的药物研发提供理论和实验依据。

1 材料

1.1 实验动物100只SPF级健康♂SD(Sprague Dawley)大鼠,体质量(270～280)g,于上海斯莱克实验动物有限公司购买[许可证号SCXK(沪)2014-0002,合格证号:2015000518015],并于福建中医药大学实验动物中心饲养[许可证号:SYXK(闽)2014-0005]。

1.2 实验药物与试剂sal(福建中医药大学,纯度>98%);LPS(Sigma公司,货号L2880);LY294002(Sigma公司,货号:L9908);柠檬酸盐缓冲液粉末(货号:17021404);cDNA逆转录试剂盒(美国Thermo公司,货号:K1622);β-actin 抗体(货号:H015)、NF-κB p50 抗体(货号:#3035)、Akt 抗体(货号:#2920)、p-Akt 抗体(货号:#4060),PCNA 抗体(货号:#13110),TRIzol(货号:AN51L758);苏木精染色液(20181204)。

1.3 实验仪器酶标仪(TECAN,InfiniteM 200Pro);荧光显微镜(德国Leica公司,型号:DMI8);石蜡切片机(Thermo Fisher公司,型号:HM325);电泳仪(美国Bio-Rad公司);RT-qPCR仪(美国Applied Biosystems公司,型号:7900H-PCR)。

2 方法

2.1 LPS造模大鼠经适应性喂养后,腹腔注射2%戊巴比妥钠(2 mg·kg-1)进行麻醉,待大鼠无脚板反应后将其固定于脑立体定位仪,剪开头皮使颅骨充分暴露,用棉球擦开黏膜使视野清晰,标记前囟位置,定位侧脑室(前囟-0.8 mm,中线外侧1.5 mm,硬脑膜下3.5 mm),埋入侧脑室注射导管,经导管注射2 μL LPS(1 g·L-1),大鼠缓冲5 min后对其伤口进行缝合。

2.2 实验动物分组与给药40只SPF级大鼠随机分为假手术组(sham组),假手术+红景天苷组(sham+sal组),模型组(LPS组),模型组+红景天苷组(LPS+sal组),sham组除不注射LPS外其余操作相同,sham组与LPS组腹腔注射0.9%生理盐水(10 mL·kg-1·d-1),sal与LPS+sal组腹腔注射sal(50 mg·kg-1·d-1)。给药1 d后取材。

60只SPF级大鼠随机分为假手术组(sham组),假手术+抑制剂组(sham+LY294002组),模型组(LPS组),模型+抑制剂组(LPS+LY294002组),模型+红景天苷组(LPS+sal组),模型+红景天苷+抑制剂组(LPS+sal+LY294002组),经2%戊巴比妥钠(2 mg·kg-1)麻醉,脑立体定位仪定位侧脑室注射10 μL 10 mmol·L-1的PI3K抑制剂LY294002(用含25%DMSO的PBS溶解),30 min后经侧脑室注射导管注射2 μL LPS(1 g·L-1),LPS+sal组和LPS+sal+LY294002组腹腔注射sal(50 mg·kg-1·d-1),其余组腹腔注射生理盐水(10 mL·kg-1·d-1),给药1 d后取材。

2.3 中性粒细胞染色将切片烘干进行脱蜡复水,柠檬酸进行抗原修复后去离子水清洗,然后将组织切片静置,待其干燥无水后,将组织片放入配置好的中性粒细胞染色液中,于37 ℃水浴锅中避光染色5 min,去离子水洗净染色液,带组织片干燥后伊红染色5 min,于光学显微镜下观察中性粒细胞阳性表达情况。

2.4 Western blot检测p-Akt、Akt及NF-κB核蛋白的表达提取组织总蛋白并使用BCA进行蛋白浓度测定,电泳将蛋白分离后,转移至PVDF膜上,室温封闭2 h,加入稀释好的一抗:NF-κB(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶2 000)、p-Akt(1 ∶2 000)、PCNA(1 ∶1 000)。4 ℃孵育过夜,TBST洗3次,10 min/次,加入含HRP标记1 ∶1 000稀释的二抗,室温孵育2 h,TBST洗3次,10 min/次,于凝胶成像分析系统检测,分析目标条带的灰度值,并统计各组差异及显著性。

2.5 RT-PCR检测TNF-α、IL-1B、CD14、iNOS mRNA的影响TRIzol法提取组织RNA,检测浓度及纯度,调齐浓度,逆转录成cDNA,以cDNA为模版,通过RT-qPCR检测IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表达。GAPDH的上游引物序列为5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′,下游引物序列为5′-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′;TNF-α的上游引物序列为5′-ACTGAACTTCGGGGTGATCG-3′,下游引物序列为5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′;IL-1β的上游引物序列为5′-TCCTGAAGCATATAACCAGTACC-3′,下游引物序列为5′-TGCGCTCTGTGTGGTCTCGTACTTAG-3′;CD14的上游引物序列为5′-TGGGCAACAACGGATACCTG-3′,下游引物序列为5′-GAACTTGGAGGGTCGGGAAT-3′;iNOS的上游引物序列为5′-CCTCCTTGTTCAACTCACCTTC-3′,下游引物序列为5′-CAATCCACAACTCGCTCCAA-3′。所用引物均由尚亚生物技术有限公司提供,以GAPDH为内参校正样品的CT值,计算2-ΔΔCT值用于基因表达的定量分析。

3 结果

3.1 中性粒细胞染色侧脑室注射LPS诱导炎症模型,给药1 d后,中性粒细胞染色结果显示,sham组大鼠细胞边缘规则,结构清晰。LPS组大鼠皮层则出现核染色加深增多,细胞边缘模糊,而经sal给药后细胞形态有所恢复,核染色总体变浅。见Fig 1。

Fig 1 Neutrophil infiltration after rhodiola glucoside role

3.2 sal对LPS诱导炎症大鼠脑内Akt磷酸化、NF-κB核蛋白表达的影响Western blot结果显示,LPS组Akt蛋白磷酸化水平降低,NF-κB蛋白表达升高;经sal作用后,与LPS模型组比较大鼠脑组织中Akt蛋白磷酸化水平明显升高,NF-κB蛋白的表达则明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结果表明,sal能够促进炎症大鼠脑内Akt磷酸化、抑制NF-κB核蛋白表达。见Fig 2。

Fig 2 Effect of salidroside on Akt phosphorylation and NF-κB nuclear protein expression n=6)

3.3 sal对LPS诱导炎症大鼠脑内IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表达影响RT-PCR结果显示,与sham组比较,LPS造模组中IL-1β,TNF-α,CD14,iNOS mRNA的表达均明显升高(P<0.01或P<0.05);经sal作用后,与LPS组相比,TNF-α,IL-1β,CD14,iNOS mRNA的表达明显降低(P<0.01或P<0.05),差异具有统计学意义,见Fig 3。

3.4 LY294002作用后,sal对LPS诱导大鼠Akt磷酸化、NF-κB核蛋白及炎症因子表达的影响为了进一步探讨sal的抗炎作用是否与PI3K/Akt信号通路密切相关,本研究采用侧脑室预埋注射导管,先注射PI3K抑制剂LY294002,30 min后,再侧脑室注射LPS造模。经sal给药1 d后,与LPS+LY294002组比较,LPS+sal+LY294002组TNF-α,IL-1β,CD14,iNOS mRNA、及核蛋白NF-κB水平无显著性差异;与LPS+sal组比较,LPS+sal+LY294002组以上各指标水平较高,且具有显著性差异,表明LY294002能够阻断sal对LPS诱导大鼠脑内炎症模型的抑制作用。见Fig 4,5。

Fig 3 Effect of salidroside on expression of TNF-α, IL-1β, CD14, iNOS mRNA n=6)

4 讨论

脂多糖可以激活免疫系统,导致过度炎症,通常用于建立各种炎症模型,技术简单,容易测量和识别,具有高重现性[10]。LPS处理后不久,便会释放高水平的促炎细胞因子,并且可以在循环血清中进行测量。本实验中LPS造模后各项炎症指标上升明显且可以看到中性粒细胞浸润情况,核染色加深,细胞形态变形,而经sal给药1 d后,能够明显改善上述情况。

PI3K/Akt是细胞中一个经典的信号通路,它的激活可导致各种自身免疫、炎症和过敏过程。研究表明,炎症反应发生后p-Akt/Akt蛋白水平显著下降[9]。LY294002是一种PI3K抑制剂[11],已广泛用于多种疾病的研究。NF-κB是一种反转录因子,对免疫和炎症反应同样至关重要,NF-κB可以被多种因素激活,其中就包括PI3K/Akt信号通路,NF-κB被激活后,与I-κB解离后进入细胞核,与κB位点结合,调控下游基因表达从而参与炎症反应[12]。结果显示,LPS造模后,AKT蛋白磷酸化表达减少,NF-κB表达升高,经sal给药1 d后可以逆转上述情况,但当我们使用抑制剂LY294002干预后,再sal给药则无上述逆转作用,表明sal可以抑制炎症反应,且是通过激活PI3K/Akt信号通路发挥作用。

TNF-α、IL-1β是典型的促炎细胞因子。TNF-α是在急性炎症期间产生的炎症细胞因子,负责细胞内的信号传导事件,导致坏死或凋亡[7]。而IL-1β参与调节宿主的先天免疫反应,可以使小胶质细胞和星形胶质细胞活化,致使中枢神经系统内其他促炎和趋化介质的下游合成[8]。CD14是免疫系统中的一种白细胞分化抗原,LPS可与CD14特异性结合,使其激活,使细胞活化,促进炎性细胞因子的产生[13-15],如TNF-α、IL-1、IL-6等,在机体免疫、防御系统引起的一系列病理反应中起关键作用。iNOS则可以通过加速NO的产生加剧炎症性反应。根据RT-PCR结果分析sal可以明显减少TNF-α、IL-1β、CD14及iNOS的表达,发挥抗炎作用。

综上所述,sal通过激活PI3K/Akt信号通路,抑制TNF-α、IL-1β、CD14、iNOS等炎症因子的表达,促进Akt蛋白的磷酸化,减少核蛋白NF-κB表达,从而发挥抗炎作用,为sal治疗神经系统炎症奠定基础。