刀豆蛋白A纯化猪流行性腹泻病毒的研究

李 兰 张浩明 杨 利 程海卫 侯立婷 张元鹏 侯继波 陈 瑾 郑其升,2,3*

(1.江苏省农业科学院 动物免疫工程研究所,南京 210014;2.江苏省食品质量安全重点实验室国家重点实验室培育基地,南京 210014;3.兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心,泰州 225300)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的仔猪腹泻是一种困扰养猪业发展的重要传染病,现阶段疫苗免疫是预防和控制 PED 的主要手段[1]。抗原是构成疫苗的关键要素,提高有效抗原含量即抗原纯化就显得尤为重要。现阶段层析技术已广泛应用于人类疫苗的纯化,该方法虽然杂蛋白去除率较高,但是由于操作中使用的纯化材料和设备造价较高[2],一定程度上阻碍了其在附加值低的兽用疫苗中的使用。所以开发新型高效、低成本的 PEDV 抗原纯化方法具有重要意义。

刀豆蛋白 A 是一种来源于豆科植物种子的凝集素[3],已被证实能够特异性结合甘露糖和葡萄糖[4],利用其识别并结合糖基的高度特异性及可逆性,已广泛应用于糖蛋白的纯化,如已用Con A分离纯化乙型肝炎表面抗原亚基、绒毛膜促性腺激素、碱性磷酸酶和茶树叶糖蛋白等[5-7]。也有利用Con A纯化病毒的相关报道,早期研究表明Con A有2个糖基结合位点,一个高亲合力结合位点,称之为主要结合位点(pS),一个低亲和力结合位点,称之为次要结合位点(sS),当糖蛋白的糖链中同时具有pS和sS 时,可以与Con A结合并产生沉淀[8-9],基于此研究人员尝试利用 Con A 沉淀囊膜病毒,通过离心,去除杂蛋白,然后于沉淀中添加含有甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的解离液去竞争Con A的2个糖基结合位点,使病毒从Con A上解离下来,释放到介质中,以实现纯化的目的,结果显示该方法可以收获纯化的病毒[10]。另有研究人员尝试将偶联 Con A的亲和层析柱应用于杆状病毒的纯化,表明 Con A可通过特异性结合病毒表面的 GP64 糖蛋白而实现杆状病毒的纯化[11]。

在前人研究的基础上,本研究利用 Con A 与 PEDV 的特异性结合,形成 Con A-PEDV 不溶性复合物,通过离心和竞争性洗脱即可实现病毒的纯化,即解析 Con A 高效纯化 PEDV 的关键因素,获得复合物形成、分离及解离3个阶段的关键技术参数,提高杂蛋白去除率和病毒回收率,为大规模纯化 PEDV 疫苗毒提供一种参考方法,也为高质量 PEDV 灭活疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

PEDV 细胞培养液由江苏省农业科学院动物免疫工程研究所提供,其滴度为106.9TCID50/mL;Vero 细胞由本课题组保存。刀豆蛋白A购自Sigma公司;甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺均购自上海源叶生物科技有限公司;PEDV 抗原检测的双抗夹心 ELISA 试剂盒由本研究团队研制;HRP 标记的羊抗鼠抗 IgG 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 试验方法

该研究中所采用的猪流行性腹泻病毒纯化方法,主要包括3个阶段:1)结合阶段:于PEDV病毒培养液中加入适量Con A,作用一定时间;2)分离阶段:离心,取沉淀;3)解离阶段:于上述沉淀中加入解离液进行解离,得到纯化后的病毒液。

1.2.1离心条件的优化

于3 mL PEDV细胞培养液中添加终浓度为60 μg/mL的Con A,室温孵育1.5 h,接着按照不同的速度离心25 min,离心速度分别是1 000、2 000、4 000、5 000、6 000、8 000和10 000 r/min,收获沉淀,加入1.5 mL含有甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(100 mmol/L)的PBS溶液作为解离液,室温解离10 min,即得纯化后的病毒,同时收获离心后上清,利用PEDV双抗夹心ELISA试剂盒检测解离液OD450,以确定合适的离心速度;接着设定最佳离心速度,其他步骤同上,考察不同的离心时间(1、2、5、10、15、20、25和30 min)对纯化效果的影响,另外以Vero细胞破碎液替代病毒培养液,作为对照组。

1.2.2Con A与PEDV病毒液作用条件的优化

于3 mL PEDV细胞培养液中分别添加不同量的 Con A和PHA,使其终浓度分别为 0、10、20、40、60、80、100和120 μg/mL,室温震荡孵育1.5 h,4 000 r/min离心25 min,收获沉淀。按上述方法进行解离,收获纯化病毒液,利用 PEDV 双抗夹心 ELISA试剂盒检测解离液 OD450,以确定Con A添加量;然后于 PEDV 细胞培养液中添加适量Con A,其他步骤同上,考察不同作用时间(0.5、1、1.5、2和2.5 h)对纯化效果的影响,另外以Vero细胞破碎液作为对照组。

1.2.3解离液的筛选及优化

竞争性糖的筛选及其浓度确定:于PBS中添加不同种类的竞争性糖:100 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(M)、100 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺(G)或其混合物(50 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和50 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺,MG);解离液中甲基-α-D-吡喃甘露糖苷浓度分别设为0、50、100、150、200、250和300 mmol/L,以确定糖的最适使用浓度。离子强度的优化:比较2种缓冲液成分的解离效果:一种是Na2HPO4-NaH2PO4磷酸盐缓冲液(PB):pH 7.5,0.01 mol/L PB,500 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷,0～80 mmol/L NaCl;另外一种是Tris-HCl缓冲液:pH 7.0,0.01 mol/L Tris,500 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷,0～80 mmol/L NaCl,解离液中NaCl浓度分别设置为0、10、30、50、60和80 mmol/L。

1.2.4病毒回收率的测定

以采用细胞半数感染量(TCID50)准确定量的PEDV细胞培养液为标准品,利用双抗夹心ELISA方法检测标准品的OD450值,建立标准品的滴度与OD450值之间线性回归关系的标准曲线。然后用双抗夹心ELISA方法检测纯化前病毒液(体积记为V1)、纯化后病毒液(体积记为V2)的OD450值,带入标准曲线,获得纯化前病毒液TCID50和纯化后病毒液的TCID50,研究中纯化前病毒液体积为3 mL,回收的病毒液体积为2.5 mL,病毒回收率按照如下公式进行计算:

病毒回收率=(T2×V2)÷(T1×V1)×100%

(1)

式中:T1为纯化前病毒液的病毒量,TCID50/mL;V1为纯化前病毒液体积,mL;T2为纯化后病毒液的病毒量,TCID50/mL;V2为回收的病毒液体积,mL。

同时为确定病毒被纯化下来,还需Western Blot鉴定,PEDV病毒培养液与Con A作用完毕,经离心收集沉淀,PBS洗涤3次,去除非特异性吸附,按病毒液1/40体积加入PBS并重悬,进行Western Blot鉴定。

1.2.5杂蛋白去除效果测定

为分析杂蛋白去除情况,收集纯化后上清和病毒液,进行SDS-PAGE鉴定;利用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化前病毒液及纯化后病毒液中总蛋白含量。总蛋白去除率按如下公式进行计算:纯化前病毒液中总蛋白浓度记为C1,体积为V1,纯化后病毒液中总蛋白浓度记为C3,体积为V3。

总蛋白去除率=

1-[(C3×V3)÷(C1×V1)]×100%

(2)

式中:C1为纯化前病毒液中总蛋白浓度,μg/mL;V1为纯化前病毒液体积,mL;C3为纯化后病毒液中总蛋白浓度,μg/mL;V3为纯化后病毒液体积,mL。

2 结果与分析

2.1 猪流行性腹泻病毒纯化离心条件的优化

利用双抗夹心ELISA方法检测纯化后病毒液及经Con A处理后Vero细胞破碎液的OD450值,图1(a)表明:当离心速度较大时,试验组和对照组解离液OD450均较高;当离心速度较小时,试验组和对照组解离液OD450均较低;因此只有当试验组解离液OD450较高,对照组解离液OD450维持在空白水平时,此时离心力最佳,为4 000 r/min。

(a)速度;(b)时间

同时随着离心时间的延长,解离液OD450逐渐升高,当离心时间≥15 min时,解离液OD450值保持相对稳定,说明最佳离心时间是15 min(图1(b))。

2.2 猪流行性腹泻病毒纯化中Con A用量及作用时间的优化

经PHA处理的PEDV病毒液的OD450值均处于空白水平,说明PHA不能与PEDV病毒粒子结合,而Con A可以与PEDV病毒粒子发生特异性结合,由图2(a)可知:当添加量小于40 μg/mL时,OD450值增加缓慢;当Con A添加量为40～80 μg/mL时,OD450值急剧上升;当Con A添加量大于80 μg/mL时,OD450值维持在最高值不变,故Con A用于PEDV纯化的最佳添加浓度为80 μg/mL。另外Con A与PEDV病毒液的最佳作用时间为2 h(图2(b))。

(a)Con A 使用浓度;(b)作用时间

2.3 猪流行性腹泻病毒纯化解离液的筛选

解离液是提高病毒回收率的关键因素之一,与 N-乙酰葡萄糖胺相比,甲基-α-D-吡喃甘露糖苷有着更高的解离效率,且其洗脱效率呈现一定的剂量依赖性,图3(b)结果显示甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的最佳使用浓度为200 mmol/L,另外,图4表明增加解离液中的离子强度,可以降低Con A与病毒的亲和力,有利于解离,当NaCl最佳浓度为50 mmol/L时,Tris缓冲液优于磷酸盐缓冲液。

(a)解离液中竞争性糖的比较;(b)甲基-α-D-甘露糖甘浓度优化

图4 解离液缓冲体系的筛选及NaCl浓度的优化

2.4 猪流行性腹泻病毒纯化后回收率检测

以表1中准确定量的PEDV细胞培养液为标准品,建立的标准曲线为y=0.493 9x+5.587 8,y为log(PEDV滴度),x为OD450值。病毒滴度在5×105～7.9×106TCID50/mL范围时,R2>0.99,CV<10%,表明双抗夹心ELISA方法重复性好、准确度高,能够稳定、快速地测定PEDV含量,可用于病毒回收率的测定。本试验的病毒回收率=(106.88×2.5)÷(106.9×3)×100%=79.4%。

表1 标准品OD450值及logTCID50的对应关系

使用猪 PEDV阳性血清作为一抗,进行 Western Blot鉴定,图5 结果显示于55 ku 大小处出现 PEDV N 蛋白特异性条带,再次证明Con A可以实现预期的纯化目的。

M:蛋白分子量标准;1:纯化前PEDV培养液;2:上清;3:纯化后PEDV病毒液。

2.5 总蛋白去除效率检测

病毒纯化通过一步低速离心即可实现,如图6所示,在25 ku左右处呈现较弱的蛋白条带,并未出现培养基、宿主细胞相对应的蛋白,由此可以确定病毒液中大部分杂蛋白已被去除,进一步经BCA测定纯化前总蛋白浓度为1.59 mg/mL,体积为3 mL,纯化后总蛋白浓度为114.9 μg/mL,体积为2.5 mL,其总蛋白去除率为1-[(114.9×2.5)÷(1 590×3)]×100%=93.9%。

M:蛋白分子量标准;1:纯化前PEDV培养液;2:上清;3:纯化后PEDV病毒液。

3 讨 论

当今疫苗免疫仍是控制病毒感染最常用的方法,随着畜牧业的快速发展,对安全、高效的高质量疫苗的需求日益增加,而杂质是影响疫苗安全性和有效性的主要因素之一,所以病毒的纯化对于疫苗的开发越来越重要,故本研究意在建立一种PEDV纯化方法。

本研究尝试使用凝集素Con A对细胞培养的PEDV进行纯化,较前人使用Con A沉淀纯化弗里德氏病毒时[10],回收率有较大提升,可达到80%左右,这可能与2种病毒表面糖蛋白的糖链组成不同有关,PEDV表面糖蛋白与Con A有较高的亲和力;研究还发现离心速度是一个关键参数,4 000 r/min对于PEDV的纯化是最佳的,当离心速度较大时,非特异性的杂质也被沉降下来,影响除杂效率;当离心速度较小时,Con A-PEDV复合物没有沉降下来,影响回收率;另外在Tris-HCl缓冲体系下,当NaCl浓度为50 mmol/L时,洗脱效果最佳,可能在此条件下,Con A的糖基结合域与糖基之间的氢键和疏水作用力减弱[12],更易解离。

囊膜病毒表面蛋白发生糖基化的现象十分普遍,至今仍在世界大流行的新型冠状病毒表面的 S 蛋白呈现高度糖基化,其N-连接糖基化位点高达66个。目前动物病毒的糖基化研究相对滞后,同为冠状病毒的 PEDV 纤突 S 蛋白具有较高程度的糖基化修饰,但其糖链类型及结构尚未见报道,也未见Con A与PEDV表面糖基是否能够发生特异性反应的相关研究。SDS-PAGE和Western Blot结果初步表明Con A能够特异性结合PEDV,而不跟培养基和宿主细胞中的蛋白结合,这为该方法具有较高的总蛋白除杂率提供了保障。后续试验将使用 PNGase F和Endo Hf 糖苷酶对PEDV进行处理,以考察Con A能否与去糖基化PEDV结合,进一步说明Con A与PEDV的结合具有糖基依赖性。

综上所述,本研究在前人研究基础上,一方面发现使用Con A纯化PEDV病毒液是可行的,另一方面确定并优化了关键技术参数,后续将对纯化病毒进行感染活性鉴定及免疫原性评估,为高质量 PEDV灭活疫苗的研发奠定基础。