长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1及微小RNA-874对气道平滑肌细胞功能改善的调控

陈璐 陈艳萍 段效军 张瑾 李林瑞 郭宽鹏

支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道炎症性疾病[1-2]。尽管在治疗方面取得了很大进展,但哮喘仍是导致肺部疾病发病率和死亡率高的重要原因[3]。转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)是一种长链非编码RNA(lncRNA),已被报道参与多种肿瘤和疾病的发生与发展[4]。微小RNA(miRNA)是长度为18～25个核苷酸的短链非编码内源性RNA,可在转录后水平调节基因表达[5]。有研究报道,miR-874的异常表达可能与过敏性鼻炎发展密切相关,并参与哮喘发病过程[6]。利用生物信息学技术预测发现,MALAT1与miR-874存在靶向调节的关系,但尚无相关研究报道。因此,本研究通过检测血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)刺激下气道平滑肌细胞(ASMCs)中MALAT1和miR-874的表达,明确MALAT1/miR-874轴在哮喘发展的过程中对ASMCs的增殖、迁移和炎性因子分泌的作用。

材料与方法

1.材料:ASMCs购自中国科学院上海细胞库;DMEM培养基、Transwell小室(8 μm)购自美国Corning公司;胎牛血清(FBS)、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒均购自美国Thermo公司;PDGF-BB购自美国R&D公司;TRIzol试剂、Lipofectamine2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购自美国Sigma公司;TaqMan microRNA逆转录试剂盒购自美国Applied Biosystems公司;ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司;miR-874 mimics、miR-874 inhibitor及阴性对照序列miR-NC和下调MALAT1表达的sh-MALAT及阴性对照序列sh-NC、携带与miR-874潜在结合位点的MALAT野生型(MALAT-WT)及其突变型(MALAT-MUT)序列均购自广州锐博生物技术有限公司;psi-CHECK2荧光素酶报告载体购自美国Promega公司;分光光度计购自美国Bio-Rad公司;双荧光素酶分析系统购自美国Promega公司。

2.方法

(1)细胞培养、转染及分组:使用含10%FBS的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养ASMCs过夜。取对数生长期ASMCs,按Lipofectamine2000转染试剂说明书方法参考文献[7]进行转染,使用25 ng/ml的PDGF-BB处理ASMCs,并将ASMCs分为正常培养的对照组(Control组)、PDGF-BB处理的PDGF-BB组[再根据处理时间分为PDGF-BB(6 h)组、PDGF-BB(12 h)组、PDGF-BB(28 h)组、PDGF-BB(24 h)组)]、PDGF-BB处理的转染sh-MALAT组(PDGF-BB+sh-MALAT组)、PDGF-BB处理的转染sh-NC组(PDGF-BB+sh-NC组)、PDGF-BB处理的转染miR-874 mimics组(PDGF-BB+miR-874 mimics组)、PDGF-BB处理的转染miR-NC组(PDGF-BB+miR-NC组)、PDGF-BB处理的联合转染sh-NC与miR-NC组(PDGF-BB+sh-NC+miR-NC组)、PDGF-BB处理的联合转染sh-NC与miR-NC组(PDGF-BB+sh-NC+miR-NC组)PDGF-BB处理的联合转染sh-MALAT1与miR-NC组(PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-NC组)、PDGF-BB处理的联合转染sh-MALAT1与miR-874 inhibitor组(PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-874 inhibitor组)。

(2)RT-PCR:采用TRIzol法提取ASMCs中总RNA,使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒合成cDNA,然后按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书方法行RT-PCR检测MALAT1、miR-874表达水平。

(3)CCK-8法:将各组ASMCs在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h后向每孔加入10 μl的CCK-8试剂,在分光光度计490 nm波长处检测每孔吸光度值代表细胞增殖能力,每组设置5个复孔。

(4)Transwell实验:取转染后ASMCs按3×104个/孔接种至Transwell小室中,并加入200 μl不含FBS的DMEM培养基进行培养,下室为600 μl按方法(3)进行处理分组。培养24 h后,4%甲醛溶液固定15 min,0.4%结晶紫染色10 min,选取5个视野在倒置显微镜下计数迁移细胞数代表细胞迁移能力。

(5)ELISA试验:取各组ASMCs的培养上清液,按ELISA试剂盒说明书方法检测IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。

(6)双荧光素酶基因报告实验:使用在线数据库starbase(2.0版;http://starbase.sysu.Eedu.cn)预测MALAT和miR-874之间的潜在结合位点。将MALAT-WT或MALAT-MUT序列和miR-874 mimics或miR-NC共同转染入psi-CHECK2荧光素酶报告载体中,并将共转染的细胞分为miR-874 mimics+MALAT-WT组、miR-NC+MALAT-WT组、miR-874 mimics+MALAT-MUT组和miR-NC+MALAT-MUT组。培养48 h后,采用双荧光素酶报告系统检测各组ASMCs中荧光素酶活性。

结 果

1.不同PDGF-BB处理时间组ASMCs中MALAT1与miR-874表达水平比较:Control组、PDGF-BB(6 h)组、PDGF-BB(12 h)组、PDGF-BB(18 h)组及PDGF-BB(24 h)组细胞MALAT1相对水平依次升高,miR-874相对水平依次降低(P<0.05)。见表1。

表1 不同PDGF-BB处理时间组ASMCs中MALAT1与miR-874表达水平比较

2.下调LncRNA MALAT1表达对ASMCs增殖与迁移能力和炎症因子水平的影响:与Control组(1.00±0.14)比较,PDGF-BB+sh-MALAT1组(0.27±0.08)细胞MALAT1表达水平降低(P<0.01),但PDGF-BB+sh-NC组(0.94±0.18)细胞MALAT1表达水平无明显变化(P>0.05)。与Control组比较,PDGF-BB组、PDGF-BB+sh-NC组和PDGF-BB+sh-MALAT1组细胞增殖能力、迁移能力和细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显增强;与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+sh-MALAT1组细胞上述能力与指标水平均明显降低(P<0.05),PDGF-BB+sh-NC组无明显改变(P>0.05)。见表2。

表2 各组ASMCs增殖与迁移能力和炎症因子水平的影响

3.过表达miR-874对ASMCs增殖与迁移能力和炎症因子水平的影响:与Control组(1.00±0.08)比较,PDGF-BB+miR-874 mimics组(4.17±0.28)细胞miR-874表达水平明显升高(P<0.01),PDGF-BB+miR-NC组(0.89±0.15)细胞miR-874表达水平无明显变化(P>0.05)。与Control组比较,PDGF-BB组、PDGF-BB+miR-NC组和PDGF-BB+miR-874 mimics组细胞增殖能力、迁移能力和细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显升高;与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+miR-874 mimics组细胞上述能力与指标水平均明显降低(P<0.05),PDGF-BB+miR-NC组无明显变化(P>0.05)。见表3。

表3 各组ASMCs增殖与迁移能力和炎症因子水平的影响

4.MALAT1与miR-874的调控关系:在线数据库Starbase预测结果显示,MALAT1和miR-874之间存在潜在结合位点。见图1。双荧光素酶基因报告实验结果表明,与miR-NC+MALAT1-WT组细胞(1.03±0.09)比较,miR-874 mimics+MALAT1-WT组细胞(0.31±0.08)荧光素酶活性显著降低(P<0.05),但miR-NC+MALAT1-MUT组(1.07±0.06)和miR-874 mimics+MALAT1-WT组(0.97±0.04)细胞荧光素酶活性改变无统计学意义(P>0.05)。与Control组(1.02±0.10)比较,转染sh-MALAT1后细胞miR-874表达水平(3.62±0.26)明显升高(P<0.01),转染sh-NC后细胞miR-874表达水平(0.93±0.11)比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 Starbase预测MALAT1和miR-874的结合位点

5.MALAT1/miR-874轴对ASMCs增殖与迁移能力的影响:与sh-NC+miR-NC组比较,PDGF-BB+sh-NC+miR-NC组、PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-NC组和PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-874 inhibitor组细胞增殖能力与迁移能力均明显升高;与PDGF-BB+sh-NC+miR-NC组比较,PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-874 inhibitor组细胞上述能力均明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组ASMCs增殖能力和迁移能力比较

讨 论

ASMCs的异常增殖和迁移在哮喘的发病机制中具有重要作用[8]。PDGF-BB能诱导ASMCs增殖和迁移,常用PDGF-BB诱导ASMCs增殖和迁移作为体外研究哮喘中ASMCs功能障碍的细胞模型[4]。MALAT1是一种进化上高度保守且广泛表达的lncRNA,可参与调控多种生理病理过程[9]。在脂多糖诱导的急性肺损伤模型中,MALAT1可通过靶向调控miR-149的表达,上调肺上皮细胞中细胞核因子-κB(NF-κB)途径的活化水平,从而促进髓样分化因子88的表达和炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌[10]。在慢性阻塞性肺疾病中,MALAT1在患者肺组织中的表达异常升高,抑制MALAT1可促进肺成纤维细胞的增殖并降低促纤维化细胞因子如纤维连接蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达[11]。而在哮喘的发病过程中,MALAT1的具体作用尚处在探究中。Huang等[12]在哮喘患者血清样本中发现MALAT1上调,miR-216a下调,抑制MALAT1可增加miR-216a的表达,并削弱ASMCs的增殖与迁移能力。本研究结果显示,PDGF-BB可促进ASMCs中MALAT1表达上调,而miR-874表达被抑制,进一步的实验结果显示,下调MALAT1或过表达miR-874均能抑制PDGF-BB作用下ASMCs增殖和迁移能力的升高,并降低细胞对炎症因子IL-6,TNF-α和IL-1β的释放。这与既往研究结果一致,均表明下调MALAT1的表达水平可抑制ASMCs增殖、迁移和炎症反应。

在哮喘中,TNF-α可显著下调胎儿气道平滑肌细胞中miR-874的表达,并抑制细胞增殖、迁移和平滑肌细胞的重塑。这提示miR-874参与哮喘发病过程,并能对ASMCs功能发挥保护作用。本研究结果也表明过表达miR-874可抑制ASMCs增殖、迁移和炎症反应。同时,本研究采用生物学信息预测发现,MALAT1与miR-874存在靶向关系,双荧光素酶基因报告实验结果与RT-PCR检测结果也证实了两者的调控关系。此外,在ASMCs的生物学行为中也表明,抑制miR-874表达部分抵消了下调MALAT1对PDGF-BB诱导的ASMCs功能的保护作用。这表明MALAT1与miR-874的相互作用影响哮喘发病中ASMCs的功能改变。

综上所述,本研究结果表明抑制MALAT1/miR-874轴表达可通过降低细胞增殖、迁移和炎症因子分泌在PDGF-BB诱导的ASMCs中发挥保护作用。