基于UHPLC-QE-MS的橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制

谢卓庭,王乃平,程晓榆,关永格,李坤寅

(1. 广州中医药大学东莞医院,广东 东莞 523000;2. 广州中医药大学第三附属医院,广东 广州 510000)

子宫肌瘤是女性最常见良性肿瘤,常伴随经量增多及经期延长、下腹包块、压迫症状,可引起不孕或流产[1]。20%～50%的育龄期女性患过子宫肌瘤[2],25%～40%的不孕与子宫肌瘤密切相关[3-4]。目前西医治疗手段有激素药物和非激素药物(如止血剂、非甾体抗炎药)、手术及放射疗法等,这些治疗方式对于有生育要求的女性并不友好,而中医药优势明显。子宫肌瘤属于中医“癥瘕”病范畴,气滞血瘀证是最常见的临床证型。橘荔散结丸为全国著名妇科泰斗罗元恺教授治疗气滞血瘀型子宫肌瘤的经典方剂,临床治疗子宫肌瘤疗效显著[5]。前期团队研究发现,橘荔散结丸能够降低子宫肌瘤细胞增殖能力,抑制大鼠子宫肌层细胞增殖[6],但该药物发挥作用的化学成分及作用机制尚不明确。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱(UHPLC-QE-MS)集高效分离、多组分定性和定量于一体,既发挥色谱高分离能力,又发挥质谱高鉴别能力,近年来成为药物分析中一项重要检测技术,被广泛用于食品药物分析、医药研究和药物残留检测领域[7]。子宫肌瘤与炎症反应关系密切,核因子-κB(NF-κB)信号通路是免疫炎症的经典通路[8],孕激素可通过阻断NF-κB激活和诱导环氧化酶-2(COX-2)来抑制子宫收缩[9]。因此,本研究运用UHPLC-QE-MS技术对橘荔散结丸化学成分进行分析,并围绕NF-κB信号通路,探讨了橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制。

1 实验材料与方法

1.1实验细胞 选择 2020年6月—2022年6月于广州中医药大学第三附属医院妇科住院行子宫全切术或子宫肌瘤剔除术的子宫肌瘤患者20例,手术后30 min内取部分子宫肌瘤组织送病理检查并确诊。本研究经广州中医药大学第三附属医院伦理委员会审核通过([2020]016)。手术室用无菌剪刀获取手术切除子宫肌瘤病灶组织约2 cm3,立即置于装有冰浴PBS缓冲液50 mL离心管中,2 h内送实验室行原代培养。

1.2试剂与药物 DMEM、胎牛血清、青链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液(美国Gibco公司,货号:C11995500BT,10270106,15140-122,25200-056,SH30256.01B);Ⅰ型胶原酶(德国BioFroxx公司,货号:1904MG100);鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体SMA(北京中杉金桥生物技术有限公司);免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(博士德生物技术有限公司)。AnnexinV-FITC凋亡试剂盒(美国BD公司);碘化丙啶(默克公司,货号:P4170,Sigma-Aldrich);米非司酮片(北京紫竹药业有限公司,规格:25 mg/片);中药饮片(广州至信药业有限公司,批号:190901,191201,200601);橘荔散结片(广州中医药大学第一附属医院,批号:20200501,20200701,20200901)。IKKα、IKBα、p65、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)抗体(北京博奥森生物技术有限公司,货号:bs-2907R,bs-1287R,bs-0465r,bs-0078r,bs-0781R)。Phospho-IkBα(Ser32)抗体(CST公司,货号:2859s);RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(杭州弗德生物科技有限公司);Trizol(美国Invitrogen公司)。

1.3仪器 超高效液相(Agilent公司,1290 UPHLC);高分辨质谱(Thermo Fisher Scientific公司,Q Exactive Focus);超声仪(深圳市方奥微电子有限公司,YM-080S);色谱柱(Waters公司,ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm×2.1×100 mm);离心机(上海安亭科学仪器厂,TDL-5);全自动显微照相倒置式系统显微镜(日本Olympus公司,PM-20);恒温CO2培养箱(美国Harris公司,SC-15);流式细胞仪(美国Beckman Comlter公司,ALTRA EPICS);蛋白电泳装置系统(Bio-RAD公司);TS-8型转移脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司);荧光定量PCR仪(美国ABI公司,7300)。

1.4药液制备方法 橘荔散结丸冻干粉:将橘核15g、荔枝核10g、莪术10g、川楝子10g、益母草10 g、小茴香10 g、乌药10 g、海藻10 g、岗稔根15 g、党参10 g、何首乌15 g、续断15 g、生牡蛎20 g、风粟壳15 g粉碎制成粗粉,按1∶8料液比加入70%酒精,回流提取2次,每次1 h,收集醇液,旋转蒸发仪浓缩(60 ℃,75 r/min)至无醇味冷冻干燥,冻干粉(质量为30 g)与原方药材(1剂原方药材为175 g)比为1∶5.8。橘荔散结丸含药液:橘荔散结丸冻干粉用DMEM培养液稀释溶解,配置不同浓度含药液(0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL)。米非司酮含药液:米非司酮片用研钵研碎,根据其分子量计算得出配置10 mL浓度为1×10-3mol/L母液需4.3 mg米非司酮,根据实验需要使用时将母液用DMEM液稀释为1×10-5mol/L工作液。均用0.22 μm微孔滤膜无菌过滤,pH试纸测其pH值至中性,-20 ℃冰箱保存备用。

1.5橘荔散结丸主要化学成分UHPLC-QE-MS技术检测方法 橘荔散结丸冻干粉及橘荔散结片共6个样本,每组检测3个样本。色谱条件:Waters UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm×2.1×100 mm)。进样量5 μL,流速为0.4 mL/min ,流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B);多步线性洗脱梯度程序:0～3.5 min 5%～15%B,3.5～6 min 15%～30%B,6～12 min 30%～70%B,12～18 min 70%～100%B,18～25 min 100%B,25～26 min 100%～5%B,26～30 min 5%B。质谱条件:每个采集周期中,质量范围在100～1 500之间,采用加热电喷雾离子源,正、负离子模式检测。参数设置:毛细管温度400 ℃;鞘气体流速45 Arb;辅助气体流速15Arb;MS全分辨率为70000;MS/MS分辨率为17 500;碰撞能量15/30/45(NCE模式);喷射电压 4.0 kV(正极)或-3.6 kV(负极)。

1.6子宫肌瘤细胞相关实验方法

1.6.1细胞培养及免疫组化鉴定 原代细胞传至第3代细胞生长融合至70%～80%时,4%多聚甲醛液室温固定,3%H2O2去离子水灭酶活性,5%BSA封闭液封闭。滴加一抗工作液鼠抗人平滑肌肌动蛋白抗体SMA和生物素二抗,DAB显色,封片,倒置显微镜下拍片。

1.6.2实验分组及干预 取对数期生长子宫肌瘤细胞,胰酶消化离心制备细胞悬液,种至6孔板,细胞密度(1～2)×105/mL。细胞生长同步时,实验分为6组,空白组常规培养,基质组加入0.05%DMSO培养,米非司酮组加入1×10-5mol/L米非司酮含药液培养,橘荔散结丸高、低浓度组分别加入2 mg/mL和1 mg/mL橘荔散结丸含药液培养。

1.6.3细胞凋亡率检测 弃上清液,用不含EDTA胰蛋白酶进行消化收集细胞,冷PBS液洗涤2次。加入1×AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。5 mL流式管每组移入细胞悬液100 μL,避光条件加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液,轻轻混匀。避光条件室温孵育15 min。每个流式管加400 μL 1×AnnexinV-FITC结合液,混匀细胞。流式细胞仪上机检测,Cell quest软件分析结果。实验重复3次。

1.6.4子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p-IKBα、p65、TNF-α、IL-6蛋白表达检测 采用Western blot法检测:取出含有细胞的6孔板,置于冰上操作。提取细胞蛋白,进行蛋白样品定量,根据测定蛋白浓度采用excel绘制标准曲线。对蛋白样品变性处理,配置完成后-20 ℃之下保存备用。配制蛋白PAGE胶,垂直装入电泳槽,80 V电压下电泳跑胶。处理好的转膜夹放入转膜槽,4 ℃条件下转膜90 min。5%脱脂牛奶封闭,先后加入一抗和二抗孵育,孵育好的PVDF膜置于自动显影仪器进行目的蛋白显影。采用Image J软件处理系统分析数据。

1.6.5子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p65、TNF-α、IL-6 mRNA表达检测 采用 qPCR 法检测:从GenBank数据库检索相应基因序列,并设计引物。提取RNA,取1 μL RNA样品,分光光度计测定OD260/280,计算RNA浓度和质量。反转录:42 ℃ 30 min, 95 ℃ 5 min,使酶失活;4 ℃冰上放置5 min,可继续PCR扩增或-20℃保存。PCR扩增:95℃ 3 min预变性;然后95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共循环35次;最后72 ℃ 10 min。调整内参,计算CT值和 mRNA表达量。

2 结 果

2.1橘荔散结丸主要化学成分 按照UHPLC-QE-MS技术条件检测,得到橘荔散结丸正、负离子模式下总离子流TIC图,见图1及图2。正离子模式能检出更多化合物,分离出663个化合物,包括195个萜类、105个黄酮类、79个生物碱类、 69个苯丙素类、43个酚类、醌类及其他类型等。相对含量占总化合物85%化学成分被认为是橘荔散结丸主要化学成分,其中冻干粉91个,中成药64个。主要化学成分冻干粉与中成药6个样本共有化合物22 个,包括水苏碱、胍基丁酸、地芰普内酯、原莪术烯醇、甜橙黄酮等。

图1 橘荔散结丸正离子模式总离子流TIC图

图2 橘荔散结丸负离子模式总离子流TIC图

2.2橘荔散结丸指纹图谱的建立 将橘荔散结丸检测所得化学成分质谱原始数值,在正负离子条件下分别进行排序,经过多点较正、谱峰匹配,得到橘荔散结丸6批样品指纹图谱叠图,见图3及图4。结果示指纹图谱重叠较好,说明橘荔散结丸质量稳定。

图3 橘荔散结丸正离子模式指纹图谱

图4 橘荔散结丸负离子模式指纹图谱

2.3橘荔散结丸主成分分析PCA模型的建立 使用SIMCA软件V16.0.2进行自动建模分析,橘荔散结丸主成分分析PCA模型建立结果示橘荔散结丸冻干粉和橘荔散结片组内重合较好,但由于制备工艺不同等因素,二者间存在一定差异。见图5。

图中横坐标PC[1]为排名第一主成分的得分;纵坐标PC[2]为第二主成分得分;每个散点代表一个样本,样本全部处于95%置信区间内

2.4子宫肌瘤细胞免疫组化鉴定结果 染色后镜下显示细胞浆内为棕黄色丝状结构为阳性反应,证实所培养细胞为子宫平滑肌瘤细胞,阳性细胞数接近100%。见图6。

图6 人原代子宫肌瘤细胞免疫组化染色镜下形态

2.5各组子宫肌瘤细胞凋亡率比较 基质组子宫肌瘤细胞早期凋亡率和晚期凋亡率与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);米非司酮组和橘荔散结丸高、低浓度组子宫肌瘤细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于空白组和基质组(P均<0.05);米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于橘荔散结丸低浓度组(P均<0.05);橘荔散结丸高浓度组早期凋亡率明显高于米非司酮组(P<0.05),晚期凋亡率与米非司酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组子宫肌瘤细胞凋亡率比较

2.6各组子宫肌瘤细胞中NF-κB信号通路炎症因子蛋白表达量比较 各组间IKBα蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05);橘荔散结丸低浓度组子宫肌瘤细胞中IKKα、p65、TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05),p-IKBα蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05);橘荔散结丸高浓度组、米非司酮组子宫肌瘤细胞中IKKα、p-IKBα、p65、TNF-α蛋白相对表达量均明显高于空白组和橘荔散结丸低浓度组(P均<0.05);橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组子宫肌瘤细胞中IL-6蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);橘荔散结丸高浓度组子宫肌瘤细胞中p-IKBα、p65、IL-6蛋白相对表达量均明显低于米非司酮组(P<0.05),IKKα、TNF-α蛋白相对表达量与米非司酮组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p-IKBα、p65、TNFα、IL-6蛋白相对表达量比较

2.7各组子宫肌瘤细胞中NF-κB信号通路炎症因子mRNA表达量比较 米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组、橘荔散结丸低浓度组子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p65、IL-6 mRNA相对表达量和米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组TNF-α mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组IKBα、p65、IL-6 mRNA相对表达量及米非司酮组TNF-α mRNA相对表达量均明显高于橘荔散结丸低浓度组(P<0.05);米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组、橘荔散结丸低浓度组IKKα mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05),橘荔散结丸高浓度组IKBα、p65、TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量与米非司酮组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组子宫肌瘤细胞中IKKα、IKBα、p65、TNFα、IL-6 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

橘荔散结丸为罗元恺教授借鉴《普济方》荔核散及《济生方》橘核丸加减化裁而成。方中橘核、荔枝核行气散结,乌药、小茴香、川楝子理气活血、散结止痛,莪术破血消癥,益母草活血化瘀通经,海藻、风粟壳软坚散结消肿,牡蛎、岗稔根散结收敛止血,党参、续断、制首乌补益脾肾正气。全方以行气活血、消癥散结攻伐为主,然不忘固复患者正气。本实验基于UHPLC-QE-MS技术对橘荔散结丸化学成分快速高效鉴定,建立橘荔散结丸总离子流图和指纹图谱,分离出橘荔散结丸663个化合物,主要包括萜类、黄酮类、生物碱类、苯丙素类、酚类等。其中萜类化合物地芰普内酯能抑制一氧化氮、TNF-α和IL-6的产生[10];黄酮类成分如柚皮苷能下调环氧化酶2(COX-2)的表达, 抑制人卵巢癌SKOV3细胞体外增殖,有明显抗肿瘤作用[11];羽扇烯酮可调控p65和NF-κB信号通路相关蛋白[12];橙皮苷能抑制NF-κB激活和IKB磷酸化[13];莪术醇可通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡[14]。本研究进一步通过细胞实验证实,橘荔散结丸能够诱导子宫肌瘤细胞凋亡,分析与橘荔散结丸中上述成分的作用有关。

细胞凋亡在生理环境中主要作用是清除有害的、损坏的或不需要的细胞[15],组织正常发育和内稳态需要细胞凋亡和增殖平衡。一些细胞周期调节因子可影响细胞分裂增殖和凋亡。细胞周期调控受细胞周期素依赖性激酶抑制剂CDKI调节,包括p21WAF1、p27、p57。其中细胞周期调节因子p21WAF1能够抑制乳腺癌组织中成体干细胞的增殖[16]。NF-κB信号通路与自发性炎症性疾病与组织的炎症反应密切相关。TNF-α是NF-κB信号通路下游因子,也是炎症和肿瘤的关键中介,可通过干预肿瘤微环境中内皮细胞炎症反应,从而影响肿瘤细胞凋亡与增殖[17-18]。肿瘤基质细胞产生炎症细胞因子如IL-6,能够吸引和募集炎症细胞进入肿瘤微环境。研究表明IL-6在炎症性自身免疫性疾病和肿瘤发病中有重要作用[19],平滑肌瘤患者肌瘤组织和血清中IL-6水平和TNF-α水平高于正常平滑肌组织[20]。笔者在预实验中使用NF-κB通路抑制剂PDTC干预人子宫肌瘤细胞,发现肌瘤细胞中IKKα、p-IKBα、p65、TNF-α、IL-6蛋白表达降低,提示NK-κB信号通路影响子宫肌瘤细胞增殖,且通路抑制剂能够抑制肌瘤细胞炎症反应[21]。米非司酮有缩小肌瘤体积作用,其能够诱导细胞凋亡,机制与降低NF-κB表达、抑制细胞迁移和新血管生成有关[22]。故本研究以米非司酮为阳性对照药物,围绕NF-κB信号通路,探讨了橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制。结果表明,橘荔散结丸能够上调子宫肌瘤细胞中IKKα、p-IKBα、p65蛋白表达,说明橘荔散结丸可以干预NF-κB信号通路传导,抑制炎症反应,阻断了肌瘤进一步发展。

综上所述,基于UHPLC-QE-MS技术验证了中药复方橘荔散结丸化学成分众多,分离出主要成分能起到抗炎免疫调节作用;橘荔散结丸治疗子宫肌瘤的分子机制与干预肌瘤细胞微环境炎症反应密切相关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。