艳锦竹芋叶斑病病原菌的分离与鉴定

张徐玥，宋蕴哲，李悦悦，聂传朋，李焰焰，蔡普默

（武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300）

艳锦竹芋（Stromanthe sanguinea Triostar）又名三色竹芋、艳锦密花竹芋等，是竹芋科（Marantaceae）紫背竹芋属（Stromanthe）的多年生草本植物[1]。艳锦竹芋原产于巴西，我国均有栽培，主要在南方地区。因其株型端正美观，叶面上绚丽多彩的斑纹深受人们喜爱，具有较高的观赏价值，是近年来流行的主要观叶植物之一[2]，目前被广泛应用于园林绿化中[3]。

竹芋科植物在生产栽培中，其叶部极易出现叶斑或叶枯等病害，影响植物的观赏价值，严重时植株容易出现死亡[4-8]。近几年，竹芋科植物在观叶植物的应用热潮中脱颖而出，我国引种品种和栽植面积都有所增加，然而病虫害问题日益严重，不少学者逐渐展开对竹芋科植物病害的研究。例如，2019 年吴碧云报道紫背竹芋炭疽病的病原菌为暹罗炭疽（Colletotrichum siamense）[9]；2020 年赵京鹏报道孔雀竹芋基腐病的病原菌为天南星丽赤壳（Calonectria spathiphylli），为国内首次报道[10]；2021 年陈灿钿等鉴定青苹果竹芋叶斑病的病原菌为平脐蠕孢（Bipolaris sivanesaniana），亦为首次报道[11]。我国引种竹芋科植物的历史不长，对其病害的研究较少[8,12]，而明确其病原菌种类是开展针对性病害防治及保障其安全生产的基础。

以福建省武夷山市武夷学院园艺大棚内采集的患叶斑病艳锦竹芋叶片为试验材料，通过对病原菌的分离纯化，对其进行致病性测定、形态学观察及分子鉴定，并结合系统发育树的分析，对引起艳锦竹芋叶斑病的病原菌进行鉴定，旨在为艳锦竹芋叶斑病的诊断及防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 艳锦竹芋病害症状观察与病叶采集

2021 年5 月，在福建省武夷山市武夷学院园艺大棚内对艳锦竹芋病症进行观察拍照，并采集病叶作为试验样品。

1.2 病原菌的分离、纯化及保存

参考方中达的常规组织分离法分离出病叶样品的病原菌并纯化[13]。将病叶样品用无菌水冲洗干净后，在超净工作台里切取若干块2 mm×2 mm 病健交界处的病叶组织，用75%酒精浸泡30 s 消毒后，无菌水冲洗3 次，风干后放置在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar,PDA）培养基中央，28 ℃恒温培养。7 d 后挑取菌落边缘菌丝转接于PDA 培养基中继续培养，重复3 次。纯化后的菌丝块（Φ5 mm）放在装有无菌水的10 mL 离心管中，置于-4 ℃冷冻保存。

1.3 病原菌的致病性测定

采用菌丝块针刺接种法，进行离体和活体两种接种方式[13]，用75%酒精和无菌水消毒健康叶片，在每片叶片上接种1 处（每处穿刺5 个小孔）。在菌落边缘切取菌丝块（Φ5 mm），菌丝面贴合接种处，覆盖湿棉球保湿。离体接种叶片置于培养皿内润湿的滤纸上，用湿棉球包裹叶片基部保湿。活体接种每盆植株用透明塑料袋隔绝污染，置于28 ℃恒温培养箱保湿培养，按日常方法管理。用无菌PDA 培养基块（Φ5 mm）做空白对照，每个处理3 次重复。接种后，观察记录叶片发病情况。

1.4 病原菌的形态学观察

观察菌株在PDA 培养基培养7 d 的菌落，测量菌落直径，观察记录菌落形态特征。观察显微形态使用插片法诱导产孢，将有分生孢子的盖玻片制成临时装片，在Nikon 相差倒置显微镜（Eclipse Ts2，成贯仪器（上海）有限公司）下观察其孢子大小、形状、产孢细胞形状和产孢方式，并对其形态进行显微拍照。

1.5 病原菌的分子鉴定

将纯化的菌株接种至新PDA 培养基中，待菌丝长满培养基，刮取适量菌丝体，采用液氮研磨样本。使用真菌基因组DNA 抽取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取纯化菌株的DNA，-20 ℃保存。1%琼脂糖检测合格后进行ITS-PCR 扩增，引物选用ITS1/ ITS4（TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ TCCTCCGCT TATTGATATGC）（引物由上海派森诺生物科技有限公司合成）。PCR 反应体系为10 μL 2×Taq PCR Master Mix 溶液、12 μL ddH2O、2 μL DNA、1 μL 上游引物和1 μL 下游引物。PCR 扩增程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃总延伸7 min，16 ℃保存。对PCR 产物进行电泳检测，后回收PCR 产物进行DNA 测序（由上海派森诺生物科技有限公司完成）。测序结果提交到国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），后用NCBI Blast 程序将拼接后的序列与NCBI 核酸数据库中的数据进行比对，从中下载8 株序列相似性高的菌株序列，并以Erysiphales sp.作为外源序列，运用MEGA11 软件，根据邻位归并（Neighbor-Joining，NJ）法，并用Bootstrap 1000 次进行检验，构建系统发育树。

2 结果与分析

1.1 艳锦竹芋病害症状

叶片内部有不规则小病斑，病健交界明显，内部发白，边缘为黄褐色，病斑边缘具明显的褐色线纹。叶片正反面均大量散生大小不等的黑褐色近圆锥形粒状凸起，以叶面为主，牢牢附着在叶片上，中心为浅褐色。新生叶片无病斑，叶面上散生大量小粒状凸起（图1）。

图1 艳锦竹芋叶斑病症状Fig.1 Symptoms of leaf spot disease of Stromanthe sanguinea ‘Triostar’

1.2 病原菌的致病性测定

将分离纯化后的菌株进行致病性测定，其中菌株YJ-2 发病情况与病叶样品内部小病斑相符，活体叶片发病较明显，初期在打孔点边缘小范围开始发病，形成干枯发黄的病斑；后期病斑蔓延融合，形成边缘明显、内部发白的块斑（图2）。离体接种和活体接种均未出现黑褐色凸起小颗粒。

图2 菌株YJ-2 的致病性测定Fig.2 Pathogenicity determination of strain YJ-2

1.3 病原菌的形态学观察

菌株YJ-2 在PDA 培养基上28 ℃培养5 d 后，菌落直径约75 mm，菌落辐射状生长，出现深浅相间的轮纹，边缘呈花瓣状；中心处菌丝为白色致密的绒絮状，边缘气生菌丝平铺（图3-a）；15 d 后，菌落出现黑色点状的分生孢子器，排列在同心圆的边缘，外缘出现黄色小点（图3-c）；菌落背面颜色渐深呈灰褐色的不规则同心环（图3-d）。菌丝呈直角状分枝（图3-e）；分生孢子梗细长分枝，少数不分枝或簇状，生出内壁芽生瓶梗型产孢细胞（图3-f）；α 型分生孢子卵圆形至长椭圆形单孢，孢子两端多有两个大油球，少数为1或3 个（图3-g）；β 型分生孢子线型，多为笔直，有的稍弯曲或弯曲呈钩状，单孢，内无油球，无隔膜（图3-h）。根据形态学观察，初步鉴定为拟茎点霉属菌（Phomopsis sp.）。

图3 菌株YJ-2 的形态学观察Fig.3 Morphological observation of strain YJ-2

1.4 病原菌的分子鉴定

拼接测序结果得出，菌株YJ-2 序列长度为530 bp（图4）。拼接后序列与NCBI 核酸数据库中的数据进行BLAST 比对，结果显示菌株YJ-2（登录号ON899814）和NCBI 数据库中拟茎点霉属菌Phomopsis sp.（登录号DQ780431.1）的相似性达99.43%。系统发育树结果显示，菌株YJ-2 与Phomopsis sp.聚为一支，置信值为97%（图5），亲缘关系比较近，结合形态学观察，将菌株YJ-2 鉴定为拟茎点霉属菌（Phomopsis sp.）。

图4 菌株YJ-2 部分测序峰图（320bp-390bp）Fig.4 Partial sequencing of strain YJ-2 (320bp-390bp)

图5 基于ITS 序列构建的菌株YJ-2 与相关菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain YJ-2 and related strains based on ITS sequences

3 讨论与结论

以武夷学院园艺大棚内患叶斑病艳锦竹芋的病叶为试验材料，通过对病原菌的分离纯化，将得到的菌株进行致病性测定，并对其形态学观察、分子鉴定，并结合系统发育树的分析，确定菌株YJ-2 为拟茎点霉属菌，是该病株艳锦竹芋叶斑病的致病菌。

拟茎点霉属是半知菌类、腔孢纲、球壳孢目，有性态为间座壳属（Diaporthe）[14]，该属寄主范围广，为害多种植物，其中包含一些观赏类植物，如竹芋科、棕榈科、凤梨科等[15-17]。拟茎点霉属的种级分类至今没有明确提出，如今还是主要依据寄主来划分，寄生在同属植物上且形态一致的菌可以划分为一个种；寄生在不同属植物上形态相似的却被划分为另一个种[18]。2008 年曾莉等曾研究发现拟茎点霉（Phomopsis marantaceae）可引起竹芋拟茎点霉叶斑病，危害多种竹芋，但未发现危害艳锦竹芋，试验病株的病症与其描述的一致[8]。

仅对艳锦竹芋叶斑病的一种致病菌进行分离和初步鉴定，今后应深入开展发病规律、孢子萌发条件、致病机理、病原菌与宿主之间关系等研究，并对鉴定的致病菌进行生防制剂的筛选，掌握更多的病害发生信息，为今后竹芋科观叶植物的病害防治提供一定的参考和理论依据。