发酵温度对低盐虾酱中主要风味物质的影响

杨兵兵，王利文，陈智慧，刘杨柳，陈椿江，孙纪录,*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.云南省曲靖农业学校生物技术学部，云南 曲靖 655000；3.黄骅市众信水产有限公司，河北 黄骅 061100）

虾酱是由小毛虾等低值虾类与食盐混合、发酵制成的糊状食品，其味道鲜美，且富含蛋白质、脂肪、类胡萝卜素和微量元素等多种营养物质[1]，深受消费者的喜爱。中国虾酱每年产量约40000 t[2]，是全球最大的虾酱生产国。传统虾酱的含盐量通常在25%～33%之间，盐含量较高。低盐虾酱是与传统虾酱发酵方法相似但含盐量较低（10%～12%）的一种新型虾酱，更为符合现代健康饮食的理念，因而更具有开发潜力与市场。

虾酱的风味是评价虾酱品质的重要指标，也是影响消费者购买的直接原因。虾酱中富含的蛋白质、脂肪等营养物质，会在发酵过程中发生降解、氧化等反应，生成游离氨基酸、游离脂肪酸和挥发性化合物等物质[3]，从而赋予虾酱特有的风味。然而，由于低盐虾酱盐含量较低，为控制微生物引发的腐败变质，目前低盐虾酱只能在寒冷季节通过自然发酵生产，从而导致发酵周期长，易受温度、天气等不可控因素的影响，产品质量不稳定，风味受影响较大。发酵温度会对发酵产品中的风味物质产生极大影响。Zhao Yuzong等[4]通过不同温度发酵黄酒研究得出，低温发酵对黄酒中的风味物质有积极的影响。Tian Xuyan等[5]通过两阶段不同温度发酵鱼研究得出，使用不同温度的两阶段发酵可以改良发酵鱼的风味。

在适宜的温度下进行低盐虾酱的恒温发酵，是目前克服依赖寒冷季节自然发酵低盐虾酱诸多缺陷的一个重要途径。然而，目前关于虾酱的研究主要是集中于传统的高盐虾酱[6-10]，对低盐虾酱的研究较少[11-12]。并且，在已报道的低盐虾酱研究中，也主要是集中于理化指标和微生物区系等方面[12]。目前，关于不同发酵温度对低盐虾酱中风味物质的影响，信息十分匮乏。

因此，为了解发酵温度对低盐虾酱中风味物质的影响，本研究分别在10、15、20 ℃和25 ℃条件下进行低盐虾酱的恒温发酵。采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法及气相色谱（gas chromatography，GC）法分别检测虾酱中的游离氨基酸和游离脂肪酸的含量。利用气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）分析鉴定虾酱中的挥发性化合物种类，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）等多元统计方法，从多个方面分析不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的差异，以期为推动低盐虾酱工厂生产中实现恒温发酵提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜢子虾（Grasshopper sub），产自河北黄骅；精制盐（未加碘）山东肥城精制盐厂有限公司。

乙腈（色谱级）美国Fisher Chemical公司；2,4-二硝基氯苯 山东英朗有限公司；冰乙酸 天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司；碳酸氢钠、碳酸钠、乙酸钠、氯仿、乙醚、正己烷、甲醇、三氟化硼甲醇络合物（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；17 种氨基酸混合标准品、十一烷酸标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec®风味分析仪 德国G.A.S公司；LC-2030 Plus液相色谱仪 日本岛津公司；7820A GC仪安捷伦科技（中国）有限公司；SPM-50智能生化培养箱宁波江南仪器厂；TGL-16MC低温冷冻离心机 长沙湘锐离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低盐虾酱的制作

选取新鲜蜢子虾为原料，清洗、沥水、称量，按照蜢子虾质量的10%添加精制盐，混匀后分装于玻璃发酵罐（每罐800 g）中，用布密封，分别于10、15、20 ℃和25 ℃的培养箱中进行恒温自然发酵，每个温度处理组作两个平行，待发酵结束后对低盐虾酱中游离氨基酸、脂肪酸和挥发性化合物进行检测。其中未发酵的低盐虾酱记作0 d。

1.3.2 游离氨基酸的测定

参考Toh等[13]的方法。称取0.5 g虾酱样品，用0.1 mol/L盐酸定容至25 mL；对其溶解液进行衍生，95 ℃避光反应150 min；取出冷却至室温，上清液过有机膜，HPLC待测。HPLC条件：Waters symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4.6 μm）；柱温：40 ℃；流动相A：乙腈；流动相B：乙酸-乙酸钠缓冲液；流速：1.5 mL/min；进样量：10 μL。每个样品做3 次平行。

1.3.3 游离脂肪酸的测定

参考Xu Yanshun等[14]的方法。称取5 g虾酱样品，置于50 mL离心管中，加入15 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，振荡混匀，静置1 h过滤，向滤液中加入5 mL生理盐水，4000 r/min离心20 min，取下层滤液氮气吹干。加2 mL 14%三氟化硼甲醇络合物和25 μL 10 mg/mL的十一烷酸内标物，60 ℃甲酯化30 min。冷却至室温，加2 mL正己烷和2 mL蒸馏水，振荡 1 min，静置分层，取上层有机相过有机膜，GC待测。GC条件：HP-88安捷伦色谱柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；流量：1 mL/min；进样口温度：270 ℃；分流比：30∶1。每个样品做3 次平行。

1.3.4 挥发性化合物的测定

检测样品制备：取虾酱样品1 g，加入20 mL顶空瓶中备用，用于GC-IMS检测。

进样条件：样品孵化温度40 ℃，孵化时间20 min，孵化转速500 r/min，采用自动顶空进样单元的方式，进样体积200 μL，进样针温度85 ℃。

GC条件：MXT-5色谱柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱温为60 ℃；运行时间为30 min；载气为N2（≥99.99%）；不分流模式进样。

IMS条件：温度为45 ℃；漂移气为N2（≥99.99%）；漂移气流速150 mL/min。

1.4 数据统计与分析

采用IBM SPSS Statistic 22.0进行数据差异统计分析；通过Origin 8.5分析数据制图；采用GC-IMS配套的VOCal软件内置NIST数据库和IMS数据库对挥发性化合物进行定性分析；采用GalleryPlot插件绘制不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性成分的指纹图谱；采用SIMCA Version 14.1对虾酱中挥发性化合物进行多元统计分析和差异风味化合物分析。

2 结果与分析

2.1 不同温度发酵的低盐虾酱中游离氨基酸组成分析

游离氨基酸是形成多种风味物质的前体[15]，因此低盐虾酱中游离氨基酸的组成及含量变化对低盐虾酱独特风味的形成十分重要。由表1可以看出，不同温度发酵的低盐虾酱中均检出17 种游离氨基酸，但游离氨基酸总含量不同：10 ℃与15 ℃两组低盐虾酱中游离氨基酸总量相近，分别为10.398%和10.174%；20 ℃与25 ℃两组的游离氨基酸总量也相近，但却显著低于10 ℃与15 ℃两组（P＜0.05），分别为6.405%和6.433%。进一步分析发现，每种游离氨基酸含量均呈现上述变化，即当发酵温度达到或超过20 ℃时，低盐虾酱中的每种游离氨基酸含量将显著降低。该结果表明，发酵温度的升高不利于低盐虾酱中游离氨基酸的积累，这可能是由于较高温度能够加速促进虾酱中游离氨基酸形成新的风味物质[16]。

游离氨基酸本身也具有风味特征，17 种游离氨基酸根据其呈味特性被分为鲜味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Pro、Gly、Ala和Lys）、苦味氨基酸（Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg和His）和无味氨基酸（Cys）4 类呈味氨基酸[17]。由图1可知，甜味氨基酸和苦味氨基酸在各组低盐虾酱中均占主导位置，且10 ℃和15 ℃发酵的低盐虾酱中鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸的含量显著（P＜0.05）高于其他两组，表明低温发酵能够赋予低盐虾酱更浓郁的滋味。其中，Glu在各组低盐虾酱呈味氨基酸中含量均较高，并在10 ℃发酵的低盐虾酱中含量最高（表1），因此，Glu被认为是低盐虾酱味道鲜美的关键氨基酸[18]，这与江津津等[19]的研究结果相似。Ala能够为发酵产品提供香甜的味道[20]，它在10 ℃和15 ℃发酵的虾酱中含量较高，能够赋予该温度发酵虾酱味道香甜温和的特点；Ala还可以作为酸味矫正剂[21]，改善虾酱中的酸味。Gao Ruichang等[22]研究也发现，Glu和Ala分别是传统虾酱中甜味与鲜味的关键氨基酸。综上所述，低盐虾酱中游离氨基酸的存在能够促进虾酱风味的形成。

图1 不同温度发酵的低盐虾酱中呈味氨基酸含量Fig.1 Flavor amino acid contents in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

2.2 不同温度发酵的低盐虾酱中游离脂肪酸组成分析

游离脂肪酸的含量主要取决于脂肪分解及脂质氧化程度[14]，其存在有利于风味物质的产生。由表2可知，各组低盐虾酱中均检出了26 种游离脂肪酸，其组成主要以肉豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、亚油酸（C18:2）以及顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）为主。然而，不同温度发酵的虾酱中游离脂肪酸含量存在显著差异。其中，20 ℃发酵的虾酱中游离脂肪酸总含量为786.814 μg/g，显著高于其他温度发酵的虾酱。并且，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸在20 ℃发酵的虾酱中含量均高于其他温度发酵的虾酱。

表2 不同温度发酵的低盐虾酱中游离脂肪酸含量Table 2 Free fatty acid contents in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

不同温度发酵的虾酱中，各种游离脂肪酸（除丁酸外）含量均随着温度升高呈先上升后下降的趋势，并在20 ℃发酵的虾酱中达到最高值。该变化可能是由于发酵温度高，虾酱中游离脂肪酸的氧化分解速度加快导致[23]。其中含量较高的C14:0、C16:0和C18:2与虾酱的酸味相关，能够赋予虾酱酸味特征[14]；EPA和DHA具有抗肿瘤、抗炎症的作用[24]，可增加虾酱的营养价值。

2.3 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物分析

2.3.1 挥发性化合物的差异谱图分析

为了能够清晰地看出样品之间的差异，利用GC-IMS对不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物进行分析，结果如图2所示。二维差异谱图中每一个点代表一种挥发性化合物，红色越深浓度越高，蓝色反之。

图2 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的GC-IMS二维差异谱图Fig.2 Two-dimensional GC-IMS spectra showing differential volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由图2可知，不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的离子迁移时间基本都集中在1.0～1.5 ms，保留时间集中在300～700 s。以未发酵的虾酱样本（0 d）为背景参照时，不同温度发酵的各组虾酱样本谱图中均呈现大量高于参照样本的红色斑点，表明经过发酵，低盐虾酱中挥发性化合物种类或含量大幅度增多。并且发酵温度不同，低盐虾酱中挥发性化合物变化也不同。该结果是由于发酵温度会影响微生物的生长繁殖，从而影响挥发性化合物的生成。

2.3.2 挥发性化合物的定性分析

根据保留指数、保留时间以及离子迁移时间，利用NIST数据库及IMS数据库对不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物进行定性分析，结果如表3所示，相对含量分布图如图3所示。

表3 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的鉴定Table 3 Identification of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

从表3可以看出，不同温度发酵的低盐虾酱中可明确定性的挥发性化合物共有69 种（单体、二聚体及三聚体），包括醇类19 种、醛类13 种、酮类13 种、酯类12 种、烯类2 种、醚类2 种、酸类1 种和其他挥发性化合物7 种。其中醇类最多，醛类、酮类次之，这与Yu Jing等[25]的研究结果相似。

结合表3和图3可以看出，20 ℃和25 ℃发酵的虾酱中氨相对含量较高，会为虾酱带来刺激性气味。这可能是由于该温度发酵会使蛋白质分解过度，生成大量氨物质。因此，其他挥发性化合物分类中由于氨的存在，其相对含量随着发酵温度的升高逐渐升高。除此之外，不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物相对含量最高的均为醇类。醇类是发酵虾酱中主要的挥发性化合物[26]，其在15 ℃发酵的虾酱中相对含量最高，为45%。虾酱中的不饱和脂肪酸能够通过氧化降解产生挥发性羰基化合物和醇类物质[27]。20 ℃发酵虾酱中不饱和脂肪酸含量最高，但醛类和醇类相对含量较低，这可能是因为该温度发酵的虾酱中氨的相对含量过高，导致其相对含量降低。其次是酮类，酮类是由不饱和脂肪酸的氧化或氨基酸降解产生，能够赋予虾酱花香和果香的气味[28]。其在未发酵的虾酱中相对含量最高，为17%。随着发酵温度的升高，含量逐渐降低。这可能是由于发酵温度升高，不利于该物质的积累[29]。

2.3.3 挥发性化合物的指纹图谱分析

为进一步直观分析不同温度发酵的低盐虾酱样本中挥发性化合物的种类及含量差异。利用GalleryPlot插件绘制挥发性成分的指纹图谱，结果如图4所示。

图4 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物指纹图谱Fig.4 Fingerprint of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由图4可知，不同发酵温度的低盐虾酱中挥发性化合物存在显著差异。经过发酵后，虾酱中的挥发性化合物明显高于未发酵时的虾酱（0 d）。

10 ℃发酵的低盐虾酱中，3-甲基丁醇、丁酮、丙酮、乙酸异戊酯、2,3-丁二酮等物质含量较高。3-甲基丁醇能够由缬氨酸和异亮氨酸转化而成[30]，赋予发酵虾酱焦糖香味和香油味[8]，2,3-丁二酮是发酵虾酱中蘑菇香气的重要来源[2]。15 ℃发酵的虾酱中，乙醇、乙酸乙酯、α-松油烯、3-羟基-2-丁酮、丁酸丁酯、戊醇等物质含量较高。3-羟基-2-丁酮能够提供令人愉悦的奶油香味，该物质是传统虾酱中典型的特征挥发性化合物[31]，α-松油烯、乙酸乙酯能够赋予虾酱水果香气。20 ℃发酵的虾酱中，2-甲基戊酸乙酯、3-己烯醇、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基丁醛、异戊酸甲酯、氨等物质含量较高。3-己烯醇、异戊酸甲酯可赋予虾酱水果香气，2,5-二甲基吡嗪能够为虾酱带来烘培香气[32]，有研究表明，温度较高能够促进美拉德反应产生吡嗪类化合物[33]。25 ℃发酵的虾酱中，戊醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、丙酸异丁酯、苯甲醛以及氨含量较高。戊醛[34]、2-庚酮[25]可赋予虾酱水果、杏仁和麦芽香气，甲基庚烯酮、丙酸异丁酯可赋予虾酱水果香气和清香香气，较高浓度的苯甲醛有助于虾酱有更明显的坚果和杏仁香气[35]。但是，20 ℃和25 ℃发酵的虾酱中氨含量过高，导致整体风味较差。由此可以看出，发酵温度对低盐虾酱中挥发性化合物的种类及含量具有较大影响，该指纹图谱可实现对不同发酵温度低盐虾酱的特征识别。

2.3.4 挥发性化合物的PCA

PCA能够根据不同样本中PC因子的贡献率评估样本之间的规律性和差异[36]。为检测不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的差异，根据挥发性化合物谱图数据，采用Origin 8.5对其进行PCA，结果如图5所示。

图5 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的PCA图Fig.5 PCA plot of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

从图5可以看出，PC1和PC2的贡献率分别为42.5%和32.1%，累计贡献率为74.6%，可以很好地反映大部分虾酱样品中的特征[37]。虾酱样品中挥发性化合物在分布图中有很好的区分，其中不同温度发酵的低盐虾酱样品中挥发物化合物之间距离较远，同一温度发酵的低盐虾酱样品中挥发性化合物聚集在一起，表明不同温度发酵低盐虾酱中挥发性化合物之间存在差异，并且单个样品的重复性较好。该结果表明通过GC-IMS可以将不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物区分开。

2.3.5 挥发性化合物OPLS-DA

为改善PCA方法的不足之处，并且强化组间的差异[38]，根据不同温度发酵低盐虾酱的挥发性化合物谱图数据，采用SIMCA Version 14.1对挥发性化合物进行OPLS-DA，结果如图6所示。

图6 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的OPLS-DA得分图（A）和置换检验图（B）Fig.6 OPLS-DA score plot (A) and permutation test (B) of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

2.3.6 差异挥发性化合物的筛选与分析

变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）能够筛选出不同温度发酵低盐虾酱中特征挥发性化合物[40]。根据OPLS-DA模型中的VIP值将每个变量对不同温度发酵低盐虾酱中风味的贡献进行量化[34]，结果如图7所示。其中VIP值越高，挥发性化合物在不同温度发酵的低盐虾酱中差异越明显[41]。

图7 不同温度发酵的低盐虾酱中挥发性化合物的VIP值Fig.7 VIP scores of volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由图7可知，不同温度发酵的低盐虾酱共筛选出12 种特征挥发性化合物（VIP＞1），包括醇类5 种、酯类3 种、酮类2 种以及氨。在发酵过程中醇类和酮类由不饱和脂肪酸的氧化降解、氨基酸降解或微生物氧化产生[42]。其中3-甲基丁醇（单体和二聚体）、乙酸乙酯二聚体、丙烯酸乙酯、2-甲基丁醛二聚体和氨单体6 种特征挥发性化合物的P值小于0.05，可作为不同温度发酵的低盐虾酱中差异挥发性化合物。为了更好地区别它们在不同温度发酵的低盐虾酱中的差异，根据这些物质的峰面积值绘制聚类热图，结果如图8所示。

图8 不同温度发酵的低盐虾酱中差异挥发性化合物的聚类热图Fig.8 Cluster heatmap of differential volatile compounds in low-salt shrimp pastes fermented at different temperatures

由图8可知，6 种差异挥发性化合物能够将不同温度发酵的低盐虾酱分为两类，分别为低温发酵（10 ℃和15 ℃）和常温发酵（20 ℃和25 ℃）。在低温发酵的低盐虾酱中，3-甲基丁醇（单体和二聚体）表达呈正相关，2-甲基丁醛二聚体在10 ℃发酵的低盐虾酱中表达呈正相关，乙酸乙酯二聚体在15 ℃发酵的低盐虾酱中表达呈正相关；在高温发酵的虾酱中，氨含量达到最高，这会对虾酱的风味造成一定的影响。由此可知，低盐虾酱中风味物质的形成与发酵温度密切相关。

3 结论

本研究评估不同发酵温度对低盐虾酱中主要风味物质的影响。结果表明，各组低盐虾酱均含有17 种游离氨基酸和26 种游离脂肪酸，其中10 ℃和15 ℃发酵的虾酱中呈味氨基酸含量高于其他两组，以甜味及苦味氨基酸为主；20 ℃发酵的虾酱中游离脂肪酸含量最高。低盐虾酱中鉴别出69 种挥发性化合物，包括醇类19 种、醛类13 种、酮类13 种、酯类12 种、烯类2 种、醚类2 种、酸类1 种和其他化合物7 种。10 ℃发酵的低盐虾酱中，3-甲基丁醇、丁酮、丙酮、乙酸异戊酯、2,3-丁二酮等含量较高。15 ℃发酵的虾酱中，乙醇、乙酸乙酯、α-松油烯、3-羟基-2-丁酮、丁酸丁酯、戊醇等含量较高。20 ℃发酵的虾酱中，2-甲基戊酸乙酯、3-己烯醇、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基丁醛、异戊酸甲酯、氨等含量较高。25 ℃发酵的虾酱中，戊醛、2-庚酮、甲基庚烯酮、丙酸异丁酯、苯甲醛以及氨等含量较高。20 ℃和25 ℃发酵的低盐虾酱中氨含量较高，导致其风味较差。筛选出6 种差异挥发性化合物，分别为3-甲基丁醇（单体和二聚体）、乙酸乙酯二聚体、丙烯酸乙酯、2-甲基丁醛二聚体和氨单体。6 种差异挥发性化合物能够将不同温度发酵的低盐虾酱分为两类，分别为低温发酵（10 ℃和15 ℃）和常温发酵（20 ℃和25 ℃）。本研究结果能够为推进商品化低盐虾酱的恒温发酵提供理论参考。