不同花色油菜ANS基因的克隆及表达分析

柳 寒

（龙岩市永定区种子技术推广站，福建 龙岩 364100）

油菜是我国重要的油料作物，是世界三大植物油来源之一。油菜的多功能利用开发是贯彻落实农业供给侧结构性改革、推进农业绿色发展要求的重要举措，有利于油菜产业的持续健康发展。其中油菜花的观赏性能在乡村旅游及美丽乡村建设中发挥了重要作用。随着油菜花色的不断丰富，人们将选育出的不同花色油菜品种或者品系运用到美丽乡村建设、创意农业中，推动了农旅融合的发展[1-3]，打造了许多乡村振兴示范典型。

彩色油菜的进一步推广应用对其花色稳定性和菜籽油品质等性状提出了更高的要求，揭示彩色油菜花色形成和调控机理，找出相关的调控因子，有助于培育稳定的彩色油菜品系，有利于利用分子辅助育种快速地将彩色性状导入到其他品质优良的油菜品种中。有研究报道，彩色油菜花瓣中含有大量花青素，花青素可能是影响油菜呈色的重要因子[4]，本研究克隆了不同花色油菜中花青素合成酶基因ANS 序列并进行分析，期望能为解析彩色油菜成色机理和彩色油菜分子标记辅助育种提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用的彩色油菜品系（红色、橙色、土黄、黄色和白色）由浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所油菜育种与栽培研究室提供。

1.2 不同花色甘蓝型油菜中ANS 基因的克隆

利用拟南芥中的ANS基因（Gene ID：AT4G22880）序列在甘蓝型油菜数据库（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）中进行比对，发现甘蓝型油菜中ANS 基因存在4 个拷贝，分别为BnaA01g12530D、BnaA03g45610D、BnaC01g14310 D、BnaC07g37670D。根据这4 个基因的序列设计4 对引物见表1，用于克隆不同花色油菜中ANS 基因的DNA 序列。使用CTAB法提取红、橙、土黄、黄和白5种不同颜色油菜的基因组DNA。使用高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技术股份有限公司生产）进行PCR 扩增，PCR反应条件为95℃预变性1 min；95℃变性20 s，58℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，36 个循环后，于72℃延伸5 min。将克隆得到的产物连入pEASY-Blunt 载体（北京全式金生物技术股份有限公司生产）中，构建测序中间载体，进行序列测定。

表1 甘蓝型油菜中ANS基因不同拷贝克隆引物Tab.1 Cloning primers for different copies of ANS gene in Brassica napus

1.3 不同花色甘蓝型油菜中ANS 基因序列的分析

使用Sequencher 软件和DNAMAN 软件进行序列拼接和序列比对分析。

1.4 ANS基因在不同花色油菜中的表达分析

取红、橙、土黄、黄和白5种不同颜色油菜花瓣，使用液氮研磨后分别取80 mg 使用RNA 提取试剂盒QIAGEN RNeasy Plant Mini kit（Qiagen 公司生产）提取总RNA。取2 μg RNA使用TransScript One-Step gDNA Remover and cDNA Synthesis试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司生产）参照试剂盒说明书合成第一链cDNA。以BnActin2 作为内标，使用油菜中ANS 基因4 个拷贝的克隆引物进行半定量PCR 分析。PCR 反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35个循环后，于72℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 不同花色油菜ANS基因的克隆与序列比较分析

甘蓝型油菜中ANS 基因存在4 个拷贝，分别为BnaA01g12530D，BnaA03g45610D、BnaC01g14310D、BnaC07g37 670D，不同花色材料中的ANS 基因4个不同拷贝编码区序列分析结果显示，BnaA01g12530D 在不同花色材料中的序列均与甘蓝型油菜基因组数据库中的参考序列一致；BnaA03g45610D 在白色花材料中未扩增出条带，在其他4 种花色油菜中的序列各不相同，其中红色材料与CK（数据库中参考序列）相比存在23 个SNP 差异，橙色与CK 相比存在21 个SNP 差异，土黄与CK 相比存在22 个SNP 差异，黄色则与CK完全一致见图1BnaC01g14310D 在不同花色材料中的序列均与甘蓝型油菜基因组数据库中的参考序列一致；BnaC07g376 70D在不同花色材料中的序列分为两组，其中红、橙、黄、白一组（序列1），与参考序列相比存在32 个SNP 差异，土黄一组（序列2），与参考序列（CK2）一致，比对结果见图2。从以上不同拷贝基因编码区测序的结果分析可以看出，ANS 基因的BnaA03g45610D 拷贝和BnaC07g37670D 拷贝在不同花色材料中的序列变异较大，其中BnaA03g45610D 拷贝在不同花色材料中序列均不相同，可能与花色存在关联，其他拷贝序列差异和花色并无明显关联。

图1 BnaA03g45610D在不同花色油菜材料中的序列比对结果Fig.1 Sequence alignment results of BnaA03g45610D in rapeseed materials of different flower colors

图2 BnaC07g37670D在不同花色油菜材料中的序列比对结果Fig.2 Sequence alignment results of BnaC07g37670D in rapeseed materials of different flower colors

2.2 ANS基因BnaA03g45610D 拷贝在不同花色油菜中的进一步验证

为了进一步验证ANS 基因BnaA03g45610D 拷贝在不同花色材料中的序列特异性，取不同系列红、橙、黄、土黄花色油菜的叶片，其中红色油菜材料取样3 种，分别为红156、红185 和红191；橙色油菜取样2 种，分别为橙905 和橙906；黄色油菜材料取样3 种，分别为浙油51、浙油50 和B57；土黄油菜1 种，为EM29。使用CTAB 法提取DNA，以H15 和H16 为克隆引物进行克隆测序。序列分析结果显示，不同系列红、橙、黄、土黄花色油菜中BnaA03g45610D 拷贝编码区序列均分别与上述红、橙、黄、土黄中的BnaA03g45610D 拷贝测序结果一致，可见，ANS 基因的BnaA03g45610D 拷贝在不同花色油菜中的序列具有特异性。

2.3 不同花色油菜花瓣中ANS基因的表达分析

ANS基因4个不同拷贝在不同花色材料中的序列变异情况存在差别，为了明确其在不同花色材料中的表达情况，以油菜BnActin2为内标，对不同花色油菜花瓣中的ANS基因做了半定量PCR 分析，结果见图3。从图3 可以看出，ANS 基因的BnaA03g45610D 和BnaC07g37670D 拷贝在红色和橙色油菜材料花瓣中的表达量与其他花色油菜相比存在差异，其中BnaA03g45610D拷贝的表达差异更为明显。其他2个拷贝在5种不同花色油菜花瓣中均未检测到明显表达。

图3 ANS基因在不同花色油菜花瓣中的表达分析Fig.Expression analysis of ANS gene in different flower colors of rapeseed petals

3 讨论

花青素是除胡萝卜素及生物碱类之外的重要成色因子之一，有研究显示彩色油菜中红色、橙色油菜花瓣中主要色素成分为花青素，ANS 是花青素合成代谢路径晚期非常关键的酶，其与植物中花青素的积累及植物的呈色有着直接的关系[5]。通过序列比对分析发现，ANS基因在油菜中存在4个拷贝。本研究分别克隆了5种不同花色油菜ANS基因的4个拷贝，发现只有BnaA03g45610D 和BnaC07g37670D 拷贝在不同花色材料中的序列变异较大，BnaA01g12530D 和BnaC01g143 10D 拷贝在不同花色材料中的序列均和参考序列完全一致。 其中BnaA03g45610D 拷贝在不同花色油菜中的序列各不相同，可用于区分花色。4个不同拷贝的cDNA全长半定量PCR 分析结果显示，同样只有BnaA03g45610D和BnaC07g376 70D 拷贝在不同花色材料花瓣中显示出表达差异，且BnaA03g45610D拷贝在不同花色中的表达差异更为明显。由此可见，ANS 基因的BnaA01g12530D 和BnaC01g14310D 拷贝可能在进化上较为保守，BnaA03g45610D 和BnaC07g37670D 拷贝则更容易产生变异，同时存在调控上的差异，很可能在彩色油菜花成色中发挥着重要作用。本研究为解析彩色油菜成色机理和彩色油菜分子标记辅助育种提供了参考。