固氮功能性菌肥的研制及其对盐碱土壤性质的影响

马立强，王小丹，张 晨，，张海潮，郭爱红

（1.华北理工大学，河北 唐山 063210；2.唐山天予环境检测有限公司，河北 唐山 063210）

氮素是植物生长过程中所必需的三大营养元素之一[1]。虽然土壤中全氮含量很多，但可直接利用的速效氮含量较少。因此，施用氮肥成为我国农业生产过程中普遍使用的补充氮元素的方法。目前来说，植物生长所需的氮元素大多来自于人工施用的工业氮肥所提供的化合态氮[2]。但是过量的施用化肥容易损坏土壤的结构，造成土壤板结、养分流失等问题，进而影响到植物的正常生长，而且还可能带来一系列的经济和社会环境方面的问题，如对水体的富营养化、地下水及居民饮用水受到硝酸盐的污染等[3]。而固氮菌肥有很好的固氮增肥作用，可以很大程度增加农作物产量，减少土壤污染，对维持耕地生态系统的平衡性意义极大。

1 固氮菌肥的研制

1.1 固氮菌的分离纯化

菌株的分离方法采用稀释平板法[4]：将10.00 g 实验室土样放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，封口后置于水浴恒温振荡器中于25℃、200 r/min 条件下振荡30 min 后，静置20 min。吸取1 mL 上清液于试管中，加入9 mL 无菌水，置于旋涡混合器上充分振荡均匀。按照上述步骤，将土壤溶液依次稀释至10-3、10-4、10-5、10-6。吸取10-4、10-5、10-6 这三个浓度梯度的土壤稀释液各100 μL，用无菌涂布棒将菌悬液均匀涂布到阿须贝氏培养基平板上[5]，静置10 min，倒置于28℃恒温培养箱中，培养2 d，观察菌落形态并记录。每个浓度设置3个重复，另设一组空白对照。

用接种环挑取具有典型固氮菌特征的菌落于LB 琼脂培养基上，进行平板划线纯化。在28℃的电恒温培养箱培养2 d后得到固氮菌的单菌落。将营养培养基上生长出的单菌落接种至斜面培养基上，封口后置于冰箱冷藏处中保存备用。

1.2 固氮菌的耐受实验

通过单因素控制变量法测定固氮菌对盐浓度、pH 值的耐受程度。

耐盐实验：配制NaCl 浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%、5%、7%和9%的100 mL LB 肉汤培养基[6]，并接种2%含量的种子液[7]。将不同盐浓度的培养基置于恒温振荡器中，于30℃、180 r/min 的条件下培养3 d。每隔4 h 取样一次测定其OD600值，记录数值并绘制出曲线。

耐pH 实验：配制pH 值分别为5、6、7、8、9 的100 mL LB肉汤培养基，并接种2%含量的种子液。将不同pH 的培养基置于恒温振荡器中，于30℃、180 r/min 的条件下培养3 d。每隔12 h取样一次测定其OD600值，记录数值并绘制出曲线。

1.3 功能性固氮菌肥载体的选择

本课题选取了玉米秸秆粉末、发酵牛粪和稻壳三种菌肥载体。三种材料各称取100 g，121℃条件下在高温蒸汽灭菌锅中灭菌2 h。将灭菌后的载体放入超净工作台中，加入无菌水混匀，使之达到“手握成团，一触即散”的状态[8]。向三种载体中各加入30 mL种子液，使菌液与载体充分混匀，即得到菌肥。将制备好的菌肥放到室温、阴凉、通风、干燥的地方保存，通过平板涂布法测定不同载体固氮菌肥中的微生物数量，记录实验数据并进行比较，从而确定出最佳载体。

1.4 固氮菌肥的制备

称取5 份灭菌完全的最佳载体各250 g，分别加入5 mL、10 mL、20 mL、30 mL、50 mL 的种子液，通过平板涂布法测定不同添加量的固氮菌肥的微生物数量，记录实验数据并进行比较，从而得到最佳菌肥制备条件。

1.5 实验结果

（1）固氮菌的筛选。本次实验筛选出一株固氮菌，经16S rDNA 鉴定后初步判断出该种菌与溶菌属同属。其菌落形态为球形、半透明、表面湿润光滑、稍有隆起。菌落图见图1 和图2。

图1 固氮菌的纯化结果Fig.1 Purification results of nitrogen-fixing bacteria

图2 固氮菌的分离结果Fig.2 Isolation resultsof nitrogen-fixing bacteria

（2）固氮菌的耐受实验。固氮菌在不同盐浓度、不同pH值的环境中培养2 d 后，其OD600值均明显高于初始值，这表明该固氮菌可以耐受盐含量为9%以下以及pH 值为5～9 的酸性或碱性环境。且固氮菌在盐含量为1%～3%的盐环境中的比空白对照组的OD600值要高，这可能是因为低盐浓度对固氮菌的生长具有促进作用。固氮菌在pH 值为7 的中性环境中OD600最高，而在pH 值为9 的碱性性环境中OD600偏低，这说明OH-浓度过高时，会抑制微生物的生长和繁殖活动。试验结果见图3、图4。

图3 不同盐环境下的生长曲线Fig.3 Growth curves in different salt environments

图4 不同pH值环境下的生长曲线Fig.4 Growth curves at different pH values

（3）菌肥最佳载体的确定。在前7天时，以玉米秸秆粉末和稻壳为载体的菌肥，其菌落数较多。从第8天开始，以发酵牛粪为载体的菌肥的菌落数量增长幅度变大，且一直保持领先；而以稻壳为载体的菌肥，其菌落数目远落后于其他组。出现这种情况的主要原因是稻壳以及玉米秸秆粉末的保水性能较差，不能为微生物生长发育提供足够的水分。而发酵牛粪的有机质含量较高，保水性能较好，可以满足微生物生长繁殖的需求。所以，制备固氮菌肥的最佳载体为发酵牛粪，试验结果见图5。

（4）菌肥最优制备条件的确定。不同浓度梯度菌肥的菌落数量增长趋势相似，均在第1天时处于较平稳的生长速度，在第20 天之后，载体上的菌落数开始下降。从实验结果来看，菌肥中的菌落数基本上与菌液的添加量成正比，即接种60 mL 菌液时，微生物数量最多。微生物的数量是判断菌肥优劣的重要标准，所以本课题中选定的制备菌肥的最佳配比为250 g发酵牛粪载体接种60 mL菌液。试验结果见图6。

图6 添加不同量菌液的菌肥的菌落数变化Fig.6 The change of colony number of bacterial fertilizer with different amount of bacterial liquid

2 功能性固氮菌肥的施用对盐碱土壤性质的影响

本次试验土壤是从河北省唐山市曹妃甸采集的滨海盐碱土，采用五点采样法进行采样[9]。土壤的基本性质见表1。

表1 滨海盐碱土的性质Tab.1 The nature of coastal saline-alkali soil

2.1 功能性固氮菌肥肥效试验

土壤样品分两部分采集，一部分将其置于冰箱降温保存，用于测定微生物数量；另一部分进行自然风干，并通过2 mm 孔径筛用于测定土壤的各种理化性质，以便后续进行数据分析。取6份筛分后的盐碱土壤，每份土壤为1.5 kg。对土样进行编号，A0、A1、A2、A3、A4、A5分别施加0 g、7.5 g、15 g、22.5 g、30 g、37.5 g功能性固氮菌肥。实验过程中，每隔3 d取一次样，测定土壤速效钾、速效氮、全氮、有机质、有效磷、pH和微生物数量指标。通过分析数据，找出土壤中菌肥的最佳投加比例，在最佳配比的基础上取样测定微生物数量。

2.2 实验结果

2.2.1 固氮菌肥对土壤速效氮及全氮的影响

施加固氮菌肥可以有效增加盐碱土壤中的速效氮和全氮含量。相比于对照组，1.5 kg 盐碱土中施加30 g 固氮菌肥时速效氮和全氮含量提升最为显著。菌肥施加量为37.5 g时，速效氮和全氮的含量反而不是最高的，这可能是因为土壤中的营养元素含量有限，不足以满足固氮微生物的生长繁殖需要，使得固氮微生物的数量减少，从而导致速效氮和全氮含量的减少。试验结果见图7和图8。

图7 不同投加量对速效氮含量的影响Fig.7 Effects of different dosages on the content of available nitrogen

图8 不同投加量对全氮含量的影响Fig.8 Effect of different dosage on total nitrogen content

2.2.2 施用固氮菌肥对土壤其他化学性质的影响

施加固氮菌肥对盐碱土的pH 值几乎没有影响，这说明该菌肥不会破坏土壤本身的酸碱性。而土壤中有机质、有效磷和速效钾的含量都有一定程度的增加，有机质含量增加了5%～20%；有效磷含量增加了1.5%～4.9%；速效钾含量增加了1.1%～4.2%。并且每1.5 kg 盐碱土中添加30 g 固氮菌肥的效果最为显著。有效磷和速效钾含量的增加是因为固氮菌在土壤中利用真菌的溶解产物形成类似腐殖质的物质，能增加土壤中解磷菌和解钾菌的数量和活性，从而使土壤中有效磷的含量增加。试验结果见图9～图12。

图9 不同投加量对pH值的影响Fig.9 Effect of different dosage on pH value

图10 不同投加量对有机质含量的影响Fig.10 Effect of different dosage on organic matter content

图11 不同投加量对有效磷含量的影响Fig.11 Effect of different dosage on the content of available phosphorus

图12 不同投加量对速效钾含量的影响Fig.12 Effect of different dosage on the content of available potassium

2.2.3 施用功能性固氮菌肥对土壤微生物数量的影响

盐碱土壤中施加固氮菌肥前微生物数量为1.45×107个/g，施加固氮菌肥后微生物数量增长到了4.25×107个/g，比未投加菌肥时增加了193.1%。造成这种现象主要原因有两点：一是固氮菌肥中含有大量的固氮菌，所以施加固氮菌肥后土壤中的微生物会大幅度增加；二是固氮菌在土壤中发挥作用，改善土壤的理化性质，有利于促进土壤中原有的微生物的生长繁殖，从而也会导致微生物数量的增加。

3 总结

本课题筛选出了一株固氮菌，经16S rDNA鉴定确定其属于溶菌属。该菌可以在9%以下的盐环境和pH 值为5～9 的酸性或碱性环境中存活。为制备固氮菌肥，选用了玉米秸秆粉末、发酵牛粪及稻壳三种材料，以菌肥中微生物数目的数量为依据，通过控制变量法确定了最佳菌肥的制备配比为250 g 固氮菌肥添加60 mL 固氮菌液。将该菌肥施加到实际贫瘠土壤中发现，土壤中的速效钾、速效氮、全氮、有机质和有效磷的含量均有一定程度的提高，且该菌肥对土壤pH 值的影响不大。这说明本课题中制得的固氮菌肥有较好的使用效果，在实际应用中有广阔的前景。