基于MAGIC群体瓠瓜白粉病抗性的全基因组关联分析

钟丽萍,王 尖,吴晓花,汪 颖,吴新义,汪宝根,鲁忠富,王华森,*,李国景,*

(1.浙江农林大学 园艺科学学院,浙江 杭州 311300; 2.浙江省农业科学院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)

瓠瓜[Lagenariasiceraria(Molina) Standl.](2n=2x=22)别名葫芦、夜开花、瓠子、地蒲,最早起源于非洲。瓠瓜在我国常年种植面积超过13万hm2,产值200多亿元,经济效益十分显著,是我国南方夏季特色蔬菜之一,主要栽培地区为浙江、福建、湖北、安徽、广东等南方省区[1]。

白粉病(powdery mildew, PM)是瓠瓜生产上最主要的病害之一,也是葫芦科其他瓜类作物中共有的病害,其分布广泛,流行性强,严重影响产量和品质。因此,选育和推广抗病品种是目前防治白粉病最经济、有效的方法,而挖掘定位抗白粉病基因/QTL、利用白粉病抗性分子标记是加快瓜类抗白粉病品种选育的前提和基础[2]。当前,其他葫芦科作物在白粉病抗病基因定位方面都有不同程度的研究。Zhang等[3]将BSA与SLAF-seq方法相结合,在黄瓜1号和6号染色体上定位到两个主要的区间,挖掘到5个黄瓜抗白粉病的候选基因;郝俊杰等[4]构建分离群体进行BSA-seq和精细定位,将黄瓜白粉病抗性基因精细定位在5号染色体上位于两个SSR标记间约238 kb的候选区段内,推测区段内TIR-NBS-LRR类基因是重点候选基因;Zhang等[5]利用QTL-seq技术在韩国黄瓜品种中定位到两个主效QTL(pm5.2和pm6.1),并找到抗白粉病的候选基因CsGy5G015660,该基因涉及编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RPK2。Cao等[6]在甜瓜第12号染色体上鉴定到新的抗白粉病QTL(qCmPMR-12),RNA-Seq分析表明,MELO3C002434基因是最有可能与抗白粉病相关的候选基因。另外,研究发现MLO类基因也是白粉病抗病中的一个大类 。在拟南芥、月季、大麦等植物中已证明某个或多个特定MLO基因突变体能够引起对白粉病的广谱抗性[7-9]。而葫芦科植物中有关MLO基因的报道较少,目前在甜瓜、黄瓜、南瓜、西瓜中利用生物信息学方法对其MLO基因家族进行了鉴定与分析[10-11],甜瓜中的CmMLO2被发现可能在白粉病的发病过程中起关键作用。但目前仅有少量关于瓠瓜白粉病抗性的研究报道,除王玲平等[12]开发了一个白粉病连锁的SCAR标记,吴晓花等[13]鉴定到2个SNPs与白粉病抗性相关外,没有抗病基因被精细定位与克隆。本课题组利用长读长测序技术(PacBio、BioNano)构建了瓠瓜高质量基因组,其contig N50(11.2 Mb)较之前的参考基因组提高了390倍[14]。这为挖掘和定位瓠瓜抗白粉病基因奠定了良好的遗传基础。

MAGIC(multi-parent advanced generation inter-cross)群体,是一种较常规F2、重组自交系等更为复杂的作图群体。MAGIC群体亲本数目较多、无群体结构干扰、重组丰富,多代杂交能有效打破较长范围内的连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD),可极大提高目标QTL定位精度。Islam等[15]利用GWAS分析11个棉花亲本构建的MAGIC群体,揭示了GhRBB1_A07基因与棉花优良纤维品质的功能关联;Bossa-Castro等[16]通过GWAS分析水稻的8亲本MAGIC群体,检测到11个和抗病相关的QTLs;Ravelombola等[17]利用GWAS评估8亲本豇豆MAGIC群体的耐盐性,鉴定到与耐盐性相关的SNPs。但至今未有葫芦科MAGIC群体的相关研究报道。

本研究利用8个瓠瓜亲本构建的MAGIC群体,以多代自交后纯合的F8代203个株系为材料,通过苗期接种白粉病鉴定不同株系的抗病表型,结合重测序获得的基因型数据开展GWAS分析,挖掘与白粉病抗性相关的显著SNP位点,分析瓠瓜白粉病抗性的候选基因,研究结果为瓠瓜抗白粉病基因克隆和分子标记辅助育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究中MAGIC群体的8个亲本为J083(抗白粉病)、HZCG(感白粉病)、J077、J120、G32、Yaohulu、J104、J098,通过多代人工自交获得纯系F8代203个株系作为研究MAGIC群体的材料(图1)[18]。

图1 八个MAGIC群体的亲本(A)和MAGIC群体构建流程图(B)Fig.1 Eight MAGIC population parents (A) and MAGIC population construction flow chart (B)

1.2 白粉病抗性表型鉴定

将203份材料的种子在3%盐酸中浸泡15 min,清水洗净后在28℃恒温培养箱中催芽,等种子露白后播于基质中,在日光温室中育苗,待幼苗长至一叶一心期移栽到18 cm×20 cm的塑料花盆内,每个株系共16株(每盆4株,3个重复,1个对照)。分别在2020和2021年对203个株系的瓠瓜白粉病抗性进行鉴定。白粉病孢子采自浙江省农业科学院海宁试验基地瓠瓜田白粉病病叶,用蒸馏水将孢子制成1×105mL-1的孢子悬浮液,采用温室喷雾接种法对二叶一心期的材料进行苗期人工接种鉴定,接种白粉病菌10 d后进行白粉病病情指数调查。根据不同的发病情况进行病情分级,计算出最后病情指数。病情指数公式:

式中:VDI为病情指数,si为发病级别,ni为相应病级级别的株数,i为病情分级的各个级别,N为调查总株数。按照沈镝等[19]制订的白粉病病级分级标准,分为0～5级。

1.3 基因型鉴定

使用CTAB法提取新鲜叶片中的DNA,基因组DNA用内切酶随机打断成短的DNA片段后,进行平末端修复。然后在DNA片段两端连接dA尾,并连接测序接头。加上接头的DNA片段经过AMPure XP磁珠进行纯化,并选择300～400 bp的片段进行PCR扩增。建好的文库经过纯化、库检,采用Hiseq X10 PE150进行双末端测序。基于PLINK v1.9软件筛选MAGIC群体的SNP标记,过滤掉MAF<0.05,H>0.1的SNP标记,根据HZCG参考基因组序列鉴定到221 043个高质量的SNPs用于后续分析(基因组上标记密度为0.059 SNP·kb-1)。

1.4 全基因组关联分析

利用Tassel软件基于GLM(PCA)、GLM(Q)、MLM(PCA+K)和MLM(Q+K)4种关联分析模型对瓠瓜MAGIC群体白粉病抗性进行GWAS分析,以-lgP≥4为标准筛选显著相关的SNP,对关联分析结果绘制相应的Manhattan-Plot和QQ-Plot,根据QQ图期望P值和预测P值的拟合程度,综合考虑后选择GLM(PCA)的模型进行瓠瓜白粉病病情指数与标记之间的关联分析。

1.5 候选基因的预测和功能注释

以瓠瓜HZCG为参考基因组,根据两年与目标性状显著关联且表型解释率较高的位点的物理位置,两端各延伸群体的LD衰减距离为边界确定候选区间的范围,根据瓠瓜基因组数据库的基因注释信息(http://www.gourdbase.cn/),对候选基因进行预测与功能注释。

2 结果与分析

2.1 瓠瓜MAGIC群体抗白粉病鉴定结果

对2020和2021年的203份株系的MAGIC群体材料进行苗期人工接种鉴定,按照病情指数将所有材料划分为5种类型:高抗(VDI为0～0.15);抗病(0.150.75)(图2)。两年的试验中均发现抗白粉病类型的分布呈现正态分布(图2、图3),在2020年和2021年呈现感病和中等抗性的株系占绝大多数,说明白粉病抗性属于数量性状,在MAGIC群体株系间差异广泛。

A和B分别表示2020年和2021年的表型数据。A and B represent phenotype data in 2020 and 2021 respectively.图2 瓠瓜MAGIC群体白粉病抗性类型Fig.2 Type of powdery mildew resistance in the MAGIC population of bottle gourd

2.2 群体结构、亲缘关系及连锁不平衡分析

基于筛选得到的SNP标记,用MEGA软件进行NJ树的构建, MAGIC群体被分成8个大类(图4-A)。使用Admixture软件进行群体结构的推断,分别假设样品的分群数(K值)为1～12,然后进行聚类。根据交叉验证错误率(cross-validation error, CV error)来确定最优分群数。当K=8时,CV error最小,所以群体结构将MAGIC群体分成8个亚群(图4-B和D)。进行主成分分析,获得各个主成分的方差解释率及群体在各个主成分中的得分矩阵,可以看出群体的遗传分类也是分成8个组(图4-C)。群体分类情况显示,MAGIC群体8个亲本亲缘关系分布合理,杂交后代重组充分,为基因定位的良好群体。MAGIC群体亲缘关系是基于TASSEL软件中pairwise IBS法计算的,计算得到的K矩阵代表不同材料间的亲缘关系(图5-A),K矩阵在关联分析中和Q矩阵效果类似,作为关联分析的协变量用于减少结果的假阳性。利用PopldDecay软件对SNP标记之间的R2进行计算,根据R2估算瓠瓜MAGIC群体的LD水平,LD衰减距离为400 kb左右(图5-B)。

2.3 全基因组关联分析(GWAS)

利用Tassel软件基于GLM(PCA)、GLM(Q)、MLM(PCA+K)和MLM(Q+K) 4种关联分析模型,以评价群体结构(Q)、主成分分析(PCA)和亲缘关系(K)对控制假阳性关联的效果。比较4个模型下观察到的P值和预期P值之间的关系,发现MLM(Q+K)和MLM(PCA+K)模型下观察的P值和预期P值之间偏离程度较大(图6),可能造成较高的假阳性关联。综合分析最终选择GLM(PCA)对瓠瓜MAGIC群体白粉病抗性进行GWAS分析(图7)。在2020年的数据中检测到204个超过阈值的SNP,在2021年中检测到50个超过阈值的SNP,经过分析筛选,两年内重复检测到46个显著相关的SNP位点(表1),位于瓠瓜4号、5号、6号、7号、8号、10号和11号染色体上,其中33个位于6号染色体上且距离较近,可能位于一个或者两个QTL内,33个SNP分布在6号染色体的24～26 MB的位置区间,其中在6号染色体上这些位点表型变异解释的范围为10%～16%。

2.4 候选基因的预测

由于MAGIC群体的LD衰减距离约为400 kb,经过与瓠瓜基因组数据库的基因注释信息(http://www.gourdbase.cn/)进行对比,在显著关联的SNP位点上下游400 kb内共找到32个与抗病相关的基因,其中预测有9个基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、有2个是非典型的R蛋白基因编码跨膜受体蛋白的富含半胱氨酸受体蛋白,还有1个基因是典型的MLO基因(表2),这3类蛋白在前人研究中[20-23]已经明确地表明与白粉病抗性相关,后续还需要进一步实验去验证。

表2 候选基因的染色体、位置、基因注释

3 讨论

瓠瓜白粉病主要由白粉菌Podosphaeraxanthii(Sphaerothecafuliginea)引起。在高湿高温的条件下,患病植株由一开始的粉末斑点逐渐蔓延至一层厚厚的白色粉末。目前生产上主要通过种植抗病品种、施用杀菌剂和轮作种植等方法来解决,但防治效果甚微,易造成环境污染和农药残留的食品安全问题。

瓠瓜作为我国南方地区夏季重要的特色瓜类蔬菜,在白粉病抗性基因的研究进展目前仍处于起步阶段。近年来,随着瓠瓜上大量的SSR、InDel、SNP标记的开发以及高密度遗传图谱、高质量瓠瓜基因组的构建[14,24],挖掘和定位瓠瓜抗白粉病基因的条件已经成熟。在传统的QTL定位中,通常使用双亲群体来确定影响表型性状基因座的基因组位置和效应大小[26-28]。这种方法通常分辨率较低,因为每个位点只分析2个等位基因,且遗传重组有限。构建MAGIC有望获得更高的遗传多样性、更小的单倍型区域、更高的重组率和更好的定位分辨率[29]。此外,由于高通量SNP基因分型平台的发展和统计方法的进步,多亲本群体现在对研究人员具有很大的吸引力。本研究是第一次在葫芦科作物中构建MAGIC群体,结合GWAS分析进行白粉病抗病基因定位。通过构建MAGIC可以更加精准、高效定位到抗病基因。

MAGIC群体亲本之一的J083是本课题组多年种质资源评价中筛选鉴定出的一份优异瓠瓜材料,在大多数瓠瓜品种都不抗白粉病的情况下,J083对白粉病的抗性达到近乎免疫水平。基于抗白粉病种质材料J083、感病品种HZCG等8个亲本构建的MAGIC群体,利用GWAS分析两年的数据,筛选出了46个与白粉病抗性显著关联的位点,进一步分析预测了12个基因可能与瓠瓜白粉病抗病相关,在已有的相关报道中这些都是属于典型的白粉病抗性基因类别,例如Zhang等[5]利用QTL-seq技术在韩国黄瓜品种中找到抗白粉病的候选基因CsGy5G015660,该基因涉及编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RPK2;Xu等[30]在41.1 kb的区域扫描到一个显性遗传的PM抗性QTL,并从jin5-508衍生的SSSL0.7系中鉴定了两个富含半胱氨酸的受体样激酶基因(Csa1M064780和Csa1M064790)作为候选基因;Cheng等[31]从甜瓜中克隆出MLO基因,并命名为CmMLO2,发现其可能在白粉病的发病过程中起关键作用。本研究为克隆抗白粉病基因明确其功能,深入解析瓠瓜抗白粉病的分子机制奠定基础,对瓠瓜抗白粉病分子育种具有重要意义,同时为葫芦科其他作物的抗白粉病研究提供有力支撑。