基于网络药理学技术探讨桑椹治疗便秘的作用机制

郭君鑫，林天宝，吕志强＊

（1. 画水君鑫家庭农场，浙江 东阳 322102； 2. 浙江省农业科学研究院 蚕桑与茶叶研究所，浙江 杭州 310021）

便秘是现代人群中比较常见的一种肠道疾病，特别是在老年人群多发，同时给患者带来一些并发症［1］。近年来，伴随着现代饮食结构的改变和生活节奏加快，便秘的发病率显著升高，严重影响着国民的身体健康［2］。中医药已被证实在临床上具有良好的便秘预防与治疗疗效。

桑椹（Fructus Mori），又名桑果、桑枣、文武实等，为桑属桑科桑树的成熟果实，是一种美味、营养价值高的浆果类水果；同时，桑椹还是我国一味传统中药材，入药始载于唐代《新修本草》；味甘、性寒；归心、肝、肾经［3］。桑椹，具有滋阴补血、生津润肠、填精补脑等功效；具有良好的抗氧化、抗微生物、抗高血糖、抗高脂血症、抗炎、抗癌作用，常用于眩晕耳鸣，心悸失眠，须发早白，津伤口渴，内热消渴，血虚便秘［4］。

桑椹已经被临床上证实具有治疗便秘的作用，但其主要活性成分、作用靶点与调控机制等尚不明确。因此，本研究以桑椹为研究对象，运用网络药理学方法筛选桑椹治疗便秘的有效成分及潜在靶点，并进行生物信息学分析，得到桑椹分子作用机制，为进一步理论研究及临床应用提供科学依据。

1 数据来源

1.1 桑椹化学成分筛选及靶点获取

从TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库中输入“桑椹”，检索药物化学组分及该组分靶基因，以口服生物利用度（OB）＞30%，并且化合物类药性（DL）＞0.1为筛选条件，检索桑椹的主要化学成分并收集化合物的相应靶点。

1.2 便秘相关靶点的获得

从Gene Cards、OMIM共2个疾病相关靶点的数据库中检索便秘相关靶点，筛选关键词设置为“constipation”，设定物种为“Homosapiens”，取2数据库共性靶点为便秘相关靶点。

1.3 药物靶点和疾病靶点交集

利用R语言，对“1.1”与“1.2”所得到的桑椹预测作用靶点和疾病靶点集合的靶点名称，取交集，得到桑椹治疗便秘的靶点。

1.4 构建药材-化合物-靶点-疾病网络图

将上述分析得到的桑椹作用便秘主要化合物以及对应靶点，导入Cytoscapev3.9.1中进行可视化，得到药材-化合物-靶点-疾病网络图，并对网络图进行分析。

1.5 靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

将筛选到的靶点蛋白于STRING 数据库（https：//string-db.org/）进行PPI网络模型构建，选择“Homo Sapiens”为分析的生物体，置信度得分设置为最高置信度（0.900）之后进行整合和评估。

1.6 GO与KEGG分析

在DAVID网站（https：//david.ncifcrf.gov/）进行靶点的基因本体（GO）功能分析和KEGG（京都基因与基因组百科全书，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。

2 结果

2.1 主要成分信息

从TCMSP（https：//old.tcmsp- e.com/tcmsp.php）数据库中输入“桑椹”，设置口服生物利用度（OB）＞30%”、“DL＞0.1”，得到桑椹中12种活性成分，见表1，共获得370个预测靶点。从Gene Cards、OMIM共2个疾病相关靶点的数据库中检索便秘相关靶点452个。通过取交集，共找到桑椹化合物治疗便秘靶点211个。

将桑椹与交集靶点导入Cytoscape中，得到药材-化合物-靶点-疾病通路网络，结果见图1。图中节点数量有214个，349条边，平均相邻节点数量为3.24。在化合物中节点最大为quercetin 和oleic acid，提示桑椹主要通过quercetin和oleic acid调控靶点发挥治疗便秘的功效。此网络中度值排名前5 的靶点为PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1和PPARG。

图1 化合物-靶点-疾病网络图Fig. 1 Network of ingredients，targets，and disease

2.2 构建蛋白互作网络（PPI）及hub蛋白的提取

将211 个靶点导入String 数据库，以互作分数（Interaction score）≥0.9为参照，获取PPI网络，共获取39个节点，100条边，平均度值为1.59，见图2。通过Degree分析识别筛选其中的hub蛋白，hub蛋白包括：AR、AKT1、BCL2、CREBBP、FABP1、HMGCR、RXRA、PPARD、PPARG、MMP1、MMP2、TIMP1、TIMP2。

图2 桑椹-便秘靶点PPI网络Fig. 2 Ppi network of targets of mulberry fruits for constipation therapy

2.3 靶点GO与KEGG富集分析

在线对于桑椹治疗便秘的作用靶点进行GO与KEGG 富集分析。通过GO 富集分析，211 靶点显著富集于127 个GO 分类（P＜0.05），其中，分子功能（MF）29个、细胞组分（CC）12个、生物学过程（BP）86个，3 个分类排名前10 位分类如图3 所示。分子功能分类，靶点主要富集于锌离子结合（zinc ion binding）、氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）与酶结合（enzyme binding）；细胞组分主要富集于液泡（cytosol）、细胞质膜（plasma membrane）和膜的整体成分（integral component of membrane）；生物学过程主要富集于药物反应（response to drug）、炎症应答（inflammatory response）和凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）。

图3 桑椹防治便秘作用靶点GO富集分析柱状图Fig. 3 Histogram of GO enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy

KEGG功能注释富集分析结果显示，211个作用靶点显著富集到28条信号通路（P＜0.05），前20条信号通路如图4 所示。可以看出，PPAR 信号通路（PPAR signaling pathway）、酒精性肝病（alcoholic liver disease）、糖尿病并发症AGR 受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、脂质与动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）、脂肪细胞内脂类分解调控（regulation of lipolysis in adipocytes）及药物代谢-细胞色素P450（drug metabolism-cytochrome P450）等。

图4 桑椹防治便秘作用靶点KEGG富集分析气泡图Fig. 4 Bubble diagram of KEGG functional enrichment analysis of targets of mulberry fruits for constipation therapy

3 讨论

桑椹性味甘寒，人肝肾经，具有滋阴补血、生津润燥功效，能治心肾不交或习惯性便秘（闽南民间草药）［5］。

本研究结果从数据库中筛选出桑椹候选活性化合物12 个，预测潜在参与便秘治疗的相应靶点211 个。通过构建活性成分和靶点网络模型并分析结果，发现度值较高的候选活性分子分别是quercetin 和oleic acid，度值较高的靶点为PTGS1、RXRA、NCOA2、HSP90AA1 和PPARG，提示桑椹主要通过quercetin 和oleic acid 调控这些靶点发挥治疗便秘的功效。通过富集分析和通路分析得出，桑椹中活性成分的靶点主要参与的生物过程包括锌离子结合、氧化还原酶活性、液泡、药物反应与炎症应答等，主要在PPAR 信号通路、酒精性肝病、糖尿病并发症AGR 受体信号通路等发挥其药理作用。