716例痰涂片抗酸染色阳性患者非结核分枝杆菌菌种鉴定及其宿主风险因素分析

高雯琬 王鹏森 杨伏萍 廖传玉 黄正谷 陈玉 李晓旭 韩梅 李同心

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)是机会致病病原体。最近几年,NTM感染导致的非结核分枝杆菌肺病(NTM-PD)在结核病高负担国家和低负担国家的患病率都急剧升高,NTM-PD正在成为一种具有全球威胁性的疾病[1-3]。由于多种因素的影响,在临床上完全区分NTM-PD与肺结核是具有挑战性的,这将导致不适当的抗结核治疗[4]。因此,准确鉴别分枝杆菌的种类对患者的诊断和治疗至关重要。此外NTM分布具有地理多样性,在中国南方地区流行率高,北方地区流行率低[2]。虽然已有研究分析了NTM的流行情况和风险因素[5-7],但每个国家和地区由于自然环境以及人群生活习惯等不同,可能还是会产生差异。因此,本研究将探索重庆及周边地区的716例痰涂片抗酸染色阳性患者中非结核分枝杆菌菌种鉴定情况及其宿主风险因素。

资料与方法

一、临床资料

收集2020年1月到2020年6月在重庆市公共卫生医疗救治中心收治的716例痰涂片抗酸染色阳性患者的临床资料,包括住址、性别、年龄、结核病史和是否具有其他病症(HIV、COPD、肝炎、糖尿病和肿瘤)。纳入标准:(1)不设年龄限制。(2)患者的痰涂片抗酸染色阳性,并均具有呼吸道不适症状。(3)影像学表现:肺部有阴影,和(或)钙化、渗出、增殖、结节、空洞、淋巴结肿大等。(4)NTM的诊断参考《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)》[8]和《NTM病治疗指南》[9],即从同一患者的两份痰液标本中是否分离出相同的菌种,来判断NTM为定植菌还是致病菌。肺结核(pulmonary tuberculosis, PTB)诊断参照国家卫生和计划生育委员会发布的现行肺结核诊断标准(WS 288—2017)。排除标准:菌种鉴定为MTB/NTM双重感染的患者和NTM为定植菌的患者。本研究获得医院伦理委员会批准(2019-015-01-KY)。

二、研究方法

采用厦门致善生物科技公司生产的NTM菌株分型试剂盒(荧光PCR溶解曲线法)对716例患者连续两次间隔24小时的晨痰标本进行菌种鉴定。按试剂说明书进行操作。采用厂家配套的提取试剂盒对患者痰液进行核酸提取,取25 μL核酸提取物或阴阳性质控对照品至预干粉PCR反应管中,盖紧PCR八连管管盖。瞬时离心数秒,进行PCR扩增和熔解曲线分析。PCR反应体系为25 μL,具体扩增反应程序为:UNG酶处理50 ℃,2 min;预变性95 ℃,10 min;变性95 ℃,15 s,退火57 ℃,20 s,延伸78 ℃,20 s,共55个循环;保温40 ℃,30 min。溶解分析程序为40 ℃～95 ℃,采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号,连续采光,升温速率为0.04 ℃/S。

三、统计学处理

本研究采用SPSS 17.0软件进行分析。采用非条件逻辑回归分析与NTM感染相关的因素,相关因素包括性别,年龄,结核病史和并发症(COPD,糖尿病,肝炎,肿瘤和HIV)。以NTM感染作为因变量(PTB=0,NTM-PD=1),建立单因素二元Logistic模型。在该模型中,将P<0.05的因素再进行多因素二元Logistic分析,计算优势比(OR)及其95%置信区间(CI),P<0.05具有统计学意义。

结 果

一、 分枝杆菌菌种鉴定情况

716例患者中有632例患者的痰液经鉴定为MTB(88.268%),37例为NTM(5.168%),10例(1.397%)为NTM和MTB双重感染,37例为定植菌(5.168%)。37例NTM患者中包含11例胞内分枝杆菌,12例脓肿分枝杆菌,6例鸟分枝杆菌,3例堪萨斯分枝杆菌,3例其他分枝杆菌,1例偶发/猪分枝杆菌和1例苏加分枝杆菌。胞内分枝杆菌(1.536%,11/716)、脓肿分枝杆菌(1.676%,12/716)和鸟分枝杆菌(0.838%,6/716)是本地NTM主要流行菌种(见图1)。

图1 NTM菌种流行情况

二、NTM宿主风险因素的单因素分析

对所有变量进行单因素分析,结果显示,地区(OR=7.586,95%CI:1.029～55.921)、COPD(OR=4.852,95%CI:1.966～11.971)、糖尿病(OR=0.107,95%CI:0.015～0.790)、HIV(OR=3.361,95%CI:1.095～10.316)和肿瘤(OR=5.488,95%CI:1.443～20.868)具有统计学差异(P<0.05)(见表1)。

三、NTM宿主风险因素的多因素分析

由于重庆地区病人比例较大(77.7%,559/719),所以本研究中将不对“地区”这一变量进行多因素分析。对筛选出来的变量(COPD、糖尿病、HIV和肿瘤)进行多因素分析,赋值变量表(见表2)。结果显示,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者(OR=0.104, 95%CI:0.014～0.793)可能感染NTM的风险较低(P<0.05);COPD(OR=5.018,95%CI:1.966～12.804)、HIV(OR=3.855, 95%CI:1.224～12.143)和肿瘤(OR=6.226, 95%CI: 1.509～25.691)是NTM感染的高风险因素(P<0.05)(见表3)。

表2 NTM感染风险因素的赋值情况

表3 非结核分枝杆菌患者基本特征的多因素Logistic回归分析结果

讨 论

近年来,NTM感染的发病率正在不断增加。大约30%的NTM感染者错误地接受结核病治疗,而且大多数NTM菌株对常规一线抗结核药物具有天然耐药性,导致治疗失败[10]。因此,NTM的流行是全球公共卫生面临的一个新挑战。NTM感染其临床和影像学表现与结核分枝杆菌有相似之处,尚未有明确的诊断办法,此外,NTM菌种的分类正在迅速更新和变化。所以,准确和及时的诊断NTM并鉴定其亚种对临床治疗和防止误诊具有重要作用[11]。

16S rRNA基因测序法是基于核酸序列的NTM菌种鉴定方法中最直接可靠的方法。有研究表明[12],本研究中所采用的荧光PCR溶解曲线法试剂与16S rRNA基因测序法的一致率能达到97%。荧光PCR溶解曲线的检测步骤较基因芯片法和PCR反向点杂交法更简单,人工耗时更少,不需要特殊的仪器。因此,本研究中所采用的荧光PCR溶解曲线法NTM分型试剂盒,适合配备荧光定量PCR仪器的各级实验室使用。

由于戈登分枝杆菌一般不具有致病性或致病性弱,分离到该菌株可能为污染或短暂的定植[8]。在本研究中,37例患者的两份痰液中仅一份分离鉴定为戈登分枝杆菌,以《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)》[8],《NTM病治疗指南》[9]和患者的临床诊断为依据,故37例戈登分枝杆菌判定为非致病菌。因此,在重庆及其周边地区,肺部NTM感染者占5.168%,胞内分枝杆菌(1.536%)、脓肿分枝杆菌(1.676%)和鸟分枝杆菌(0.838%)是主要流行菌种。在2019年有文章指出,在重庆地区NTM流行的主要菌种分别是脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌和偶发/猪分枝杆菌[13]。这与本研究所得结果有所不同,可能有两种原因造成该结果,一是由于本研究所收集的病人信息和样本时间段为新冠疫情初始阶段,这必将导致许多病人因为疫情原因不能及时到院治疗。二是前者的研究中所用的方法学为PCR反向点杂交法,两种方法的检测原理不同,其敏感度也可能不同。

在不同地区与国家,NTM菌种的流行分布情况是不同的。在欧洲和北美,鸟分枝杆菌、蟾分枝杆菌和偶发分枝杆菌是主要流行菌种。而在南美,NTM流行的菌种主要是鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌和偶发分枝杆菌[14]。这主要是因为NTM菌种流行具有地理多样性,例如温度、湿度和人群生活习惯的不同。

本研究在NTM感染的相关风险因素分析中发现COPD是NTM感染的高风险因素。COPD可通过引起黏膜损伤和局部免疫损伤而导致NTM易感性增加,包括分泌物清除障碍、气道表面液体成分异常、痰液成分异常以及持续性炎症引起的气道损伤[15]。Piersimoni C.[16]也指出在免疫功能正常的成人中,NTM肺病多继发于先前有呼吸道阻塞和/或呼吸道结构破坏的慢性基础肺病患者中。这些患者的粘液纤毛清除功能和气道分泌物排除功能明显受损,因此为NTM的定植和发展提供了合适的微环境,从而导致机会感染[17]。同时,NTM感染也可能导致COPD患者的疾病进展和肺功能恶化[18]。

免疫系统受损导致无法清除体内的非结核分枝杆菌,是NTM感染的关键因素。因此T细胞数量低下或功能缺陷的患者面临NTM感染的风险更大。HIV感染者,特别是CD4+T细胞计数低于50/uL的患者,更容易感染NTM[19]。在本研究中,我们也证实了这一点。相较于非肿瘤患者,肿瘤患者也可能因为体内免疫系统受到破坏而导致NTM感染。而与非糖尿病患者相比,糖尿病患者的NTM感染风险可能较低,与其他研究报道一致[5]。目前对于糖尿病是否为NTM感染的低风险因素,并未有详细的研究。

综上所述,在本研究中NTM主要流行的菌种是胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌。此外,COPD、HIV和肿瘤是NTM感染的高风险因素。在临床工作中,临床医生应该多意识到这些相关因素与NTM的关联,并使用所有可用的诊断工具来确认或排除NTM感染。但本研究仍然存在一定的局限性,如患者纳入数量不够多、时间不够长等,未来我们将继续收集NTM和MTB的相关信息,进一步完善本研究。