地榆皂苷Ⅱ抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞的作用机制

蒋永旭,陈 颖,汪 雷,孙绪强,唐梅梅,赵飞雨,王启源,王宏婷,2,王存琴

(1.皖南医学院 药学院 安徽省皖南地区植物药活性筛选与再评价工程实验室 安徽省多糖药物工程技术研究中心,安徽芜湖 241002;2.山东大学 基础医学院,山东 济南 250000)

乳腺癌是威胁全球女性健康的第一大癌症杀手,对广大女性生命健康造成极大威胁[1]。近年来,以基因为靶点探讨乳腺癌的发生发展机制和应用相关的靶向药物已成为乳腺癌诊断治疗的新趋势,对提高晚期乳腺癌患者生存率具有十分重要的意义。因此,寻找新型、高效的抗乳腺癌靶向药物是目前亟待解决的问题。

很多抗癌药物来源于天然产物或者其衍生物,比如紫杉醇、长春碱、喜树碱等[2-3],已在临床上取得了良好的疗效。研究发现[4-5]植物中的三萜类成分被证明具有显著的抗肿瘤活性,并通过多种通路发挥抑制肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,影响细胞周期,诱导细胞程序性死亡,抗新生血管生成,减轻氧化应激等作用。地榆皂苷Ⅱ(Ziyuglycoside Ⅱ)是在苦丁茶等天然植物中提取分离得到的一种三萜类皂苷成分,有研究表明其具有良好的抗肿瘤作用[6-10],但该化合物对乳腺癌MDA-MB-468细胞的生物学作用尚未见报道。本研究旨在探讨Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞增殖、克隆、迁移和凋亡的影响以及潜在的作用机制,为其在治疗乳腺癌方面的进一步开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人MDA-MB-468乳腺癌细胞(中国科学院上海生命科学研究所细胞库)。

1.1.2 主要药物及试剂 地榆皂苷Ⅱ(植标化纯生物公司);L-15培养基(Biosharp);胎牛血清(Gibco);CCK-8试剂盒、EdU细胞增殖试剂盒(TMB法)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(碧云天);Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(翌圣生物);GAPDH、cleaved caspase-3抗体(CST);羊抗兔IgG-HRP(Biosharp);CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech)。

1.3 实验仪器 激光共聚焦显微镜(Leica);酶标仪(BioTek);流式细胞仪(BD FACSVerse);倒置显微镜(OLYMPUS);凝胶成像系统(GE,Amersham lmager 600)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人MDA-MB-468乳腺癌细胞,L-15培养基培养,添加10%胎牛血清、1%双抗,置于37℃细胞培养箱中常规培养。

1.2.2 CCK-8实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到96孔板中,贴壁后给予不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、0.75、1.5、3、6、12、24、48、96 μmol/L)处理,每组设置6个平行复孔,孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续培养2 h,酶标仪检测450 nm处吸光度值,计算各组细胞存活率,实验重复3次。

1.2.3 EdU实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到96孔板中,贴壁后给予不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、3、6、12、24、48、96 μmol/L)处理,每组设置6个平行复孔,孵育24 h后每孔加入终浓度为10 μmol/L的EdU工作液,继续培养2 h,随后根据说明书内容进行后续操作,酶标仪检测370 nm处吸光度值,实验重复3次。

1.2.4 形态学实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到24孔板中,贴壁后给予不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、5、10、20 μmol/L)处理24 h后,在倒置显微镜下进行观察拍照,实验重复3次。

1.2.5 平板克隆实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到6孔板中,贴壁后给予不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)处理,在37℃细胞培养箱培养10 d。终止培养,4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS清洗2次,用结晶紫染色30 min,PBS清洗2次,自然晾干,拍照,实验重复3次。

1.2.6 划痕实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到6孔板中,长满后无菌枪头在板内划线,PBS清洗2次,给予含2%血清的不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、2.5、5、10 μmol/L)处理,孵育0、24、48 h时,在倒置显微镜下观察细胞迁移情况并拍照,使用ImageJ软件对图像进行划痕面积分析,实验重复3次。

1.2.7 细胞凋亡实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到6孔板中,贴壁后给予不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、5、10 μmol/L)处理24 h。0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化,同时收集上清液中的悬浮细胞,1 000 r/min,离心5 min,Binding Buffer重悬细胞,加入FITC和PI染料,避光室温反应15 min,流式细胞仪进行检测。使用FlowJo软件进行图像的处理分析,实验重复3次。

1.2.8 JC-1线粒体膜电位检测实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到共聚焦小皿中,贴壁后给予不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ(终浓度为0、5、10 μmol/L)处理24 h。PBS清洗,加入1 mL培养基和1 mL JC-1工作液,37℃培养箱孵育20 min,吸去上清,JC-1染色缓冲液清洗2次,加入2 mL正常培养基,激光共聚焦拍照观察,根据红绿荧光强度判断线粒体膜电位变化,使用ImageJ软件对图像进行平均荧光强度分析,实验重复3次。

1.2.9 免疫荧光实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞,然后接种到装有细胞爬片的24孔板中,贴壁后加入10 μmol/L Ziyuglycoside Ⅱ处理24 h。弃培养基,PBS清洗,4%多聚甲醛溶液固定15 min,PBS清洗,山羊血清封闭液封闭后加入一抗cleaved caspase-3(1∶100),4℃孵育过夜。PBS清洗3次,加入二抗CoraLite488(1∶100),室温避光孵育2 h,PBS清洗3次,加入DAPI染料,避光孵育10 min,PBS清洗3次,防荧光淬灭剂封片,激光共聚焦拍照。使用ImageJ软件对图像进行平均荧光强度分析,实验重复3次。

1.2.10 Western blot实验 收集对数期生长的MDA-MB-468乳腺癌细胞接种到6孔板中,贴壁后加入10 μmol/L Ziyuglycoside Ⅱ处理24 h。RIPA冰上裂解细胞30 min,4℃ 12 000 r/min离心30 min,BCA蛋白浓度测定。加入蛋白上样缓冲液,100℃煮沸5 min,经SDS-PAGE电泳,转膜至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,TBST清洗3次,每次5 min,加入一抗GAPDH、cleaved caspase-3(1∶1 000),4℃孵育过夜。二抗IgG-HRP孵育1 h(1∶10 000),TBST清洗3次,每次5 min,ECL发光显影。使用ImageJ软件测定各条带灰度值,结果以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值表示,实验重复3次。

2 结果

2.1 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞增殖的影响 CCK-8结果显示,在Ziyuglycoside Ⅱ处理下,细胞存活率呈浓度依赖性下降,细胞增殖受到明显抑制,IC50=8.803 μmol/L(图1A);EdU结果显示,与Control组相比,随着给药浓度增大,细胞OD值呈浓度依赖性降低(F=65.450,P<0.001,图1B)。

A.CCK8实验检测不同浓度ZiyuglycosideⅡ处理24 h后的细胞活力;B.EdU实验检测不同浓度Ziyuglycoside Ⅱ处理24 h后的细胞增殖情况。与Control组比较,nsP>0.05,***P<0.001。

2.2 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞形态的影响 与Control组相比,随着Ziyuglycoside Ⅱ给药浓度增大,细胞间隙减小,折光增强,细胞萎缩,伴随大量细胞死亡,悬浮细胞明显增多。见图2。

2.3 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞克隆形成能力的影响 MDA-MB-468单个细胞克隆缓慢,形成的细胞克隆簇较小,与Control组相比,随着给药浓度的增大,克隆数均减少,差异有统计学意义(F=166.900,P<0.001)。见图3。

与Control组比较,***P<0.001。

2.4 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞迁移能力的影响 在MDA-MB-468细胞中,划痕24 h时,与Control组相比,10 μmol/L Ziyuglycoside Ⅱ抑制细胞迁移(F=4.071,P=0.0253)。划痕48 h时,与Control组相比,随着给药浓度的增大,细胞迁移率逐渐降低(F=57.810,P<0.001)。见图4。

与Control组比较,nsP>0.05,*P<0.05,***P<0.001。

2.5 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞凋亡的影响 如图5A所示,与Control组相比,MDA-MB-468细胞经Ziyuglycoside Ⅱ处理后,细胞早期凋亡比例增大(F=55.510,P<0.001,图5B),细胞晚期凋亡比例也增大(F=90.830,P<0.001,图5C),并呈浓度依赖性。

与Control组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.6 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞线粒体膜电位的影响 如图6A所示,与Control组相比,Ziyuglycoside Ⅱ处理后,红色荧光比例不断下降(F=42.250,P<0.001,图6B),绿色荧光比例不断升高(F=156.900,P<0.001,图6B),提示Ziyuglycoside Ⅱ使MDA-MB-468细胞线粒体膜电位下降,诱导细胞发生凋亡。

与Control组比较(红光),**P<0.01,***P<0.001;与Control组比较(绿光),#P<0.05,###P<0.001。

A.免疫荧光法检测cleaved caspase-3蛋白平均荧光强度;B.Western blot法检测cleaved caspase-3蛋白相对表达量。与Control组比较,**P<0.01。

2.7 Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞cleaved caspase-3蛋白的影响 与Control组相比,Ziyuglycoside Ⅱ处理后,cleaved caspase-3蛋白平均荧光强度增强(t=8.367,P<0.01,图7A);Western blot实验结果也表明,Ziyuglycoside Ⅱ上调MDA-MB-468细胞cleaved caspase-3蛋白表达(t=8.014,P<0.01,图7B)。

3 讨论

2020年全球最新癌症负担数据显示[11],全球新发乳腺癌患者达到226余万例,已取代肺癌成为全球第一大癌症,且发病率呈年轻化趋势,对广大女性健康造成重大威胁。手术协同化疗药物仍是至今治疗乳腺癌的主要手段,但化疗药物易产生毒副作用和耐受性,影响临床疗效[12]。研究发现,约60%～75%患者出现骨转移,这也是晚期转移性乳腺癌最常见的远处转移部位,严重影响患者自主活动能力和生活质量[13-14]。因此,寻找新型、有效的抗乳腺癌药物仍是目前亟待解决的问题。Ziyuglycoside Ⅱ是一种三萜类化合物,研究表明其具有很好的抗肿瘤作用[6-10],有望成为一种新型抗癌候选药。

细胞增殖失调是癌症特征之一,异常活跃且持续的增殖信号是人类肿瘤恶性增殖的表现,严重影响患者生命健康。CCK-8结果显示,Ziyuglycoside Ⅱ处理24 h后可以显著抑制MDA-MB-468细胞增殖,并呈浓度依赖性,IC50值为8.803 μmol/L,EdU实验进一步表明,随着给药浓度增大,细胞内DNA合成受到抑制,细胞增殖能力明显受到抑制,同时平板克隆实验发现,在1.25 μmol/L Ziyuglycoside Ⅱ处理时,细胞克隆数显著降低,Ziyuglycoside Ⅱ在低浓度时就有很好地抑制乳腺癌细胞增殖的作用。晚期乳腺癌患者预后差且易转移是乳腺癌细胞高度恶性的结果,因此,抑制癌细胞转移可能是改善乳腺癌患者预后的关键,本研究结果显示,Ziyuglycoside Ⅱ可以抑制MDA-MB-468细胞迁移。这些研究结果初步表明,Ziyuglycoside Ⅱ可以显著抑制乳腺癌细胞增殖、克隆、迁移,表现出显著的抗肿瘤活性。

细胞凋亡途径被激活通常被认为是一种抗癌过程[15]。半胱天冬酶家族的成员在细胞凋亡的开始和执行中起着至关重要的作用,可以促进遗传不稳定或受损细胞的消除。很多传统的抗癌药物通过间接地作用半胱天冬酶来诱导细胞凋亡而杀灭癌细胞,其中半胱天冬酶-3(Caspase-3)作为一种关键的凋亡效应因子,激活时通常被认为促进凋亡并诱导肿瘤细胞死亡[16-17]。Annexin V-FITC/PI和JC-1染色实验发现,Ziyuglycoside Ⅱ处理后,早期及晚期细胞凋亡比例明显升高,且线粒体膜电位降低。免疫荧光及Western blot实验结果显示,与Control组相比,Ziyuglycoside Ⅱ组cleaved caspase-3蛋白表达明显升高。这些结果表明,Ziyuglycoside Ⅱ可以降低线粒体膜电位,并激活Caspase-3诱导细胞凋亡。

综上所述,Ziyuglycoside Ⅱ可以抑制乳腺癌细胞增殖、克隆、迁移,并诱导细胞凋亡。本研究初步探究了Ziyuglycoside Ⅱ对MDA-MB-468细胞的作用机制,为Ziyuglycoside Ⅱ在治疗乳腺癌方面的进一步开发和利用提供依据。