胸腔积液lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9水平对肺腺癌的诊断价值*

邢贞泉,赵光强,李柳霞

三亚市人民医院/四川大学华西三亚医院呼吸内科,海南三亚 572000

肺癌是发病率、死亡率均较高的恶性肿瘤,大部分患者确诊时已进入中晚期,5年总生存率低于10%[1],提高早期诊断率和及时干预是改善肺癌患者预后的重要内容。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型,其中约50%为肺腺癌,目前临床主要采用病理活检或影像学手段进行早期诊断,但均存在一定局限性[2]。相关报道显示,肺癌是引发胸腔积液的主要因素,而随着无创分子诊断技术的发展,为胸腔积液中肿瘤特异性分子标志物来诊断恶性肿瘤提供了更多选择[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类不编码蛋白质但参与肿瘤发生发展调控的RNA,能进入胸腔积液、血液等体液中稳定表达,目前已经在肺癌诊断及预后评估中发挥作用。lncRNA膀胱癌相关转录本1(BLACAT1)、lncRNA癌症易感性候选物9(lncRNA CASC9)均已发现在多种恶性肿瘤中高表达,但关于其在肺腺癌胸腔积液中表达的相关研究较少[4-5]。本研究通过检测肺腺癌患者胸腔积液中lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9表达,分析其对肺腺癌的鉴别诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年1月至2022年12月本院收治的96例肺腺癌合并胸腔积液患者作为肺腺癌组,其中男50例,女46例;年龄36～78岁,平均(58.72±10.36)岁;临床分期:Ⅰa期9例,Ⅰb期14例,Ⅱa期28例,Ⅱb期21例,Ⅲa期18例,Ⅲb期6例。纳入标准:(1)经病理学或细胞学诊断为原发性肺腺癌[6],且影像学诊断存在胸腔积液;(2)标本采集前未进行放化疗、免疫治疗等。排除标准:(1)存在胸腔引流禁忌证者;(2)合并严重肝肾功能障碍、心脑血管疾病者;(3)存在其他恶性肿瘤;(4)患者病例资料不全、不配合进行检查或主动退出者。另选取该院同期收治的82例肺部感染合并胸腔积液患者为对照组,其中男43例,女39例;年龄34～80岁,平均(59.19±9.38)岁;肺结核53例,肺炎29例。两组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会审核通过,所有患者知情并签署知情同意书。

1.2胸腔积液采集方法 两组患者均采用胸腔引流术干预并提取胸腔积液标本20 mL,1 060 r/min离心5 min后取沉淀;在沉淀中加入红细胞裂解液吹打,并于室温放置5 min,随后以520 r/min离心5 min后取沉淀;在沉淀中加入磷酸盐缓冲液(PBS)吹打洗涤,并以1 060 r/min离心5 min,可根据血红素含量重复该步骤,最后获得的沉淀采用Trizol试剂吹打,并在-80 ℃保存备用。

1.3实时荧光定量PCR(qPCR)检测胸腔积液lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9表达水平 将冻存的标本室温放置解冻,取其中500 μL沉淀加入100 μL 氯仿(CHCl3)溶液混匀后放置5 min,随后以12 000 r/min离心10 min,取白色沉淀并加入75%乙醇清洗,随后采用7 970 r/min离心5 min后弃去上清液,沉淀在室温下干燥至无色透明,随后将其溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)中,测定提取的总RNA的纯度。根据相关引物序列逆转录合成cDNA,并以此作为模板进行PCR反应。反应条件:预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 5 s,延伸60 ℃ 5 s,共40个循环。每个标本重复测3次,lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9相对表达水平以2-ΔΔCt表示,内参基因为GAPDH。引物序列:lncRNA BLACAT1上游引物为5′-GGAGATGTGCTGGTGGTGGAATG-3′,下游引物为5′-GTTATGGAGGAGGCTGGGAGAGAG-3′;lncRNA CASC9上游引物为5′-GGCTGGAGAGTCATTGGCACTATC-3′,下游引物为5′-GCTTCCATTGCTTTGCTGCTGTC-3′;GAPDH上游引物为5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游引物为5′-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′。

2 结 果

2.1肺腺癌组和对照组胸腔积液lncRNA BLACAT1及lncRNA CASC9表达水平比较 肺腺癌组胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9相对表达水平明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9 比较

2.2不同临床病理肺腺癌患者胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9表达水平比较 以lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9在96例肺腺癌患者中相对表达水平的平均值(分别为1.72、6.63)为临界值,将患者分为高、低表达两组,其中lncRNA BLACAT1表达与肺腺癌患者临床分期、淋巴结转移、分化程度有关(P<0.05),lncRNA CASC9表达与患者临床分期、分化程度有关(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征肺腺癌组患者胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9表达比较(n)

2.3胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9联合诊断肺腺癌模型 采用Logistic回归模型建立胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9联合鉴别诊断肺腺癌模型:Logit(P)=1.933×lncRNA BLACAT1+0.448×lncRNA CASC9-3.987。见表3。

表3 胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9联合诊断肺腺癌模型

2.4lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9对肺腺癌的诊断价值 建立ROC曲线,分析结果显示胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9诊断肺腺癌的曲线下面积(AUC)分别为0.782、0.789,二者联合检测的AUC为0.878,高于单项指标诊断。见表4。

表4 胸腔积液lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9对肺腺癌的诊断价值

3 讨 论

肺癌是目前发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤之一,早期无特异性临床症状,病理活检是其诊断的金标准,但部分患者接受度不高[7-8]。胸腔积液是肺腺癌常见并发症,标本获取更为简单,且对其进行细胞病理学检测也是临床诊断的重要依据[9]。近年来,随着临床检测技术的不断进展,胸腔积液中肿瘤标志物表达情况检测为恶性肿瘤诊断提供了新的途径。

lncRNA表达异常与肿瘤发生发展及预后不良有关,lncRNA BLACAT1是一种定位在染色体1q32.1上的具有促癌作用的lncRNA,目前已经发现其在结直肠癌、宫颈癌、膀胱癌等恶性肿瘤患者血清及癌组织中表达上调,且血清lncRNA BLACAT1表达对大多数肿瘤的诊断效能更高[10-12]。目前关于lncRNA BLACAT1在NSCLC患者中表达的研究主要集中在癌组织及体外实验中。有研究发现,NSCLC患者组织中lncRNA BLACAT1表达高于健康人,且lncRNA BLACAT1高表达患者总生存期明显短于低表达患者[13];相关细胞实验显示,lncRNA BLACAT1高表达能促进肺癌细胞增殖及上皮间质转化[14]。本研究检测了肺腺癌患者及肺部良性病变患者胸腔积液lncRNA BLACAT1的表达,结果发现肺腺癌组胸腔积液lncRNA BLACAT1相对表达水平明显高于对照组,且与肺腺癌患者临床分期、淋巴结转移、分化程度有关,证实了lncRNA BLACAT1在肺腺癌患者中表达上调,这可能来自胸膜上转移的肿瘤细胞产生lncRNA BLACAT1并将其释放到胸腔积液中[15]。有研究发现,干扰lncRNA BLACAT1基因表达能通过上调miR-374b-5p来抑制肺腺癌细胞A549的增殖及转移相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达[16];还有研究显示,下调lncRNA BLACAT1在耐药NSCLC细胞中表达后能逆转细胞对阿法替尼耐药性[17]。以上研究均证实,lncRNA BLACAT1与肺腺癌发生及进展有关。本研究中,ROC曲线分析结果显示,lncRNA BLACAT1诊断肺腺癌的AUC为0.782,提示其在肺腺癌诊断中具有一定的临床价值。

lncRNA CASC9也是一种常见的促癌lncRNA,目前已经发现其在NSCLC组织及细胞中高表达,且其在癌组织中表达水平与患者生存期有关[18]。有研究显示,lncRNA CASC9能通过调控miR-195-5p/CDK6信号来参与肺鳞癌进展[19]。有研究发现,lncRNA CASC9能通过调控miR-335-3p/miR-195-5信号促进胰腺癌细胞增殖和侵袭[20]。本研究结果显示,lncRNA CASC9在肺腺癌患者胸腔积液中表达上调,且与患者临床分期、分化程度有关,提示lncRNA CASC9在胸腔积液中的表达水平可在一定程度上反映肺腺癌的发生及进展。有学者通过检测胸腔积液中lncRNA CASC9表达发现其诊断胸腔积液良恶性的AUC为0.794。本研究通过ROC曲线分析发现,lncRNA CASC9诊断肺腺癌的AUC为0.789,而lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9联合诊断肺腺癌的AUC为0.878,高于单项指标诊断,提示lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9联合应用对诊断肺腺癌具有较高的临床价值。

综上所述,lncRNA BLACAT1、lncRNA CASC9在肺腺癌患者胸腔积液表达均上调,且与肺腺癌患者临床病理有关,二者联合对肺腺癌具有较好的临床诊断价值。但本研究尚有不足之处,一是样本量较少,二是与肺腺癌关系相关调控机制尚不明确,后续将扩大样本量,并对相关作用机制进行深入研究。