自动化封闭式CAR-T细胞制备系统研发与实验

李衍珂, 李 祥

(上海交通大学 机械系统与振动国家重点实验室,上海 200240, E-mail: 1302449799@qq.com)

恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命,是人类致死疾病的最大病因[1]。嵌合抗原受体T细胞免疫(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)疗法被认为是治疗癌症最具潜力的治疗方法之一[2],该疗法的成功实施需要在体外环境下制备、扩增CAR-T细胞。尽管具有积极的临床结果,但CAR-T细胞制备成本高昂,超过25万美元[3],而且制备工艺涉及开放的人工手动操作流程[4],会带来极大的污染风险和批次质量差异等问题,因此,全封闭、自动化、可溯源的CAR-T细胞制备系统的研发迫在眉睫。

目前,欧美国家已开发出多款CAR-T细胞自动化制备系统。其中,德国Miltenyi公司的CliniMACS ProdigyTM是迄今为止市面上最符合CAR-T细胞全自动制备准则的自动化、集成化的CAR-T制备与监测系统,它将CAR-T细胞制备过程中所需的全部制备装置、监测系统、动力系统、液体储存系统、人机接口都集成在一个细胞制备平台上[5],极大降低了成本、简化了流程,但是该设备售价昂贵,高达数百万元,这无疑极大提高了细胞治疗的门槛,不利于CAR-T疗法的普及。 国内市场上尚未出现商业化的CAR-T细胞自动化制备系统,东南大学的肖忠党教授团队开展了CAR-T 细胞自动化制备系统的设计和软硬件研发工作,但是该系统缺乏对溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)浓度的监测与控制,并且对培养环境中温度、CO2浓度的监测控制是使用商品化的独立模块,没有实现系统集成[6]。

根据CAR-T细胞制备工艺流程,开发一套符合GMP管理规范的全封闭自动化CAR-T细胞制备与监控系统。该系统的管路部分包括一次性反应器、密闭管路和一次性医用试剂袋,采用无菌接合方式,管路通过0.22 μm过滤器与大气相通,实现系统整体的全封闭;机电控制部分由程序控制夹管阀的时序开断和蠕动泵的精确旋转,实现免疫磁珠、培养液、病毒、蛋白等物料的自动定量添加,程序控制舵机驱动条形磁铁转位机构,实现对T细胞的吸附分选;培养环境核心参数监控部分由下位机在线采集温度、pH、CO2浓度、DO浓度传感器数据并实时调控在最适范围内。

1 系统设计

1.1 系统原理与CAR-T细胞制备流程

CAR-T细胞的制备流程包括采集患者的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)悬液、免疫磁珠分选、激活、转导、扩增CAR-T细胞、收集CAR-T细胞并回输到患者体内[7],整个流程要在符合GMP管理规范的环境下进行,并要严格做好不同生产环节之间的高效、无菌衔接。

系统原理图如图1(a)所示,系统外接PBMC悬液、培养液、生理盐水、蛋白、磁珠、病毒载体等物质的一次性医用储液袋,以及CAR-T细胞产品收集袋和废液收集袋。管道、储液袋和反应器均做到全封闭、一次性,通过0.22 μm过滤器与外界相通,既保证了整个管道系统的气压平衡,又防止了外界的污染源进入管道系统;根据初始细胞量和不同阶段的增殖量,反应器结构设计为阶梯式,内部有各传感器的固定位置和混合气体接入口;系统使用夹管阀控制各个位置管路的开合,使用蠕动泵驱动液体在管路内流动,使用步进电机柔和振荡反应器使得细胞可以充分接触氧气和养分,且利于细胞间的通讯[8],磁铁转位机构使用舵机驱动条形磁铁旋转实现T细胞分选;细胞培养环境监控模块由温度、pH、CO2浓度、DO浓度传感器和加热膜、流量计构成,传感器通过数字口、模拟口和串口与下位机连接,实现实时数据采集与反馈,配合控制程序调控培养环境核心参数稳定在最适范围内。

图1 系统图

首先将一次性管路、生物反应器等接入系统设定位置;利用条码枪扫描患者PBMC储液袋的条形码,系统自动读取患者信息;然后,系统按照预设程序开始CAR-T细胞的自动化制备,自动化制备流程如下:泵入患者PBMC至反应器,将CD3/28免疫分选磁珠泵入反应器并柔和振荡,促使免疫磁珠与T细胞的充分结合,磁铁转位机构转入反应器底部,充分吸附固定磁珠,排出废液,完成对T细胞的分选;泵入15 mL细胞培养液,自动加入病毒载体以转导T细胞;开启细胞培养扩增,期间持续柔和振荡反应器,维持液体温度在(37±0.5)℃范围内,实时在线监控pH、CO2浓度、DO浓度并及时补充新鲜培养液、磁珠、蛋白;细胞培养扩增结束后,开启细胞收集,磁铁转位机构转入反应器底部,排出废液,分离CAR-T细胞与杂质,泵入生理盐水,完成对CAR-T细胞的洗涤,将残留在8 μm滤膜的CAR-T细胞充分转移至反应器内,最后将CAR-T细胞泵入细胞收集袋,CAR-T细胞制备过程结束。系统当前所处的CAR-T细胞制备流程、加入试剂的种类与体积、操作者的软件操作记录都以日志文件的形式被详细记录下来,便于溯源。CAR-T细胞自动化制备系统原型样机实物图如图1(b)所示。

1.2 机电控制系统架构设计

机电系统设计架构图如图2所示,使用电脑作为上位机、Arduino Mega 2560控制板作为下位机。上位机接入条码枪扫描患者条形码、读取患者信息,系统当前所处的CAR-T细胞制备流程、加入试剂的种类与体积、操作者的软件操作记录都以日志文件的形式被详细记录下来,便于溯源;下位机连接控制继电器、步进电机驱动器,控制夹管阀、蠕动泵、步进电机和舵机的时序动作;上位机与下位机之间通过串口RS-232进行实时通信。温控模块采用加热膜、液体温度传感器、位式控制技术将细胞培养液的稳定控制在(37±0.5)℃;pH控制模块使用pH传感器和平衡控制程序实时监控反应器中细胞培养液的pH值变化,并将pH数据实时传送给下位机,维持培养体系的弱碱性;CO2浓度控制模块使用CO2浓度传感器配合夹管阀,结合反馈控制算法,使得反应器内CO2浓度始终维持在适于细胞生长的5%;DO控制模块使用DO传感器获取培养液中DO的实时浓度数据,并结合CO2浓度数据决定气瓶阀门的开闭以更新反应器内气体环境。

图2 机电控制系统架构设计图

1.3 生物反应器设计

利用Catia软件建立生物反应器三维模型如图3(a)所示,反应器包含一个液体输入输出接头;根据初始细胞量和不同阶段的增殖量,设计阶梯式反应器结构,确保每个阶段的最佳细胞密度和悬液容积。如图3(b)所示为反应器内部结构图,初始培养区位于液体接头处,该区域有利于减少磁珠的损耗、增强磁场力对磁珠的吸附作用,便于细胞分选过程的高效进行;为了便于控制,使用步进电机[8]带动反应器正反旋转,配合容器内的叶片结构,形成对培养液的柔和振荡,从而使得细胞可以充分接触氧气和养分,细胞之间的通讯信号联系更为容易,且使用步进电机具有精度高、速度范围宽等特点[9]。反应器底部的温控模块用于对反应器内的液体进行加热、保温,为细胞增殖提供适宜的温度环境。磁铁转位机构驱动条形磁铁进入反应器底部,吸附固定磁珠,实现分选T细胞的功能。反应器外部有孔径8 μm的聚丙烯滤膜过滤器,用于T细胞的过滤分离。

图3 反应器图

2 实验

2.1 培养环境核心参数监控实验

人体细胞生长增殖最适宜的温度范围为(37±0.5)℃[10],因此需要确保反应器中的培养液温度上升到该范围内并持续保温。实验中间隔向反应器通入培养液,使得反应器的液体量分别达到15 mL、30 mL、100 mL、200 mL、300 mL、400 mL,以模拟细胞增殖过程中,不断向反应器添加新鲜培养液的过程。每加入一次培养液后,加热膜依据Arduino Mega 2560所采集到的液体温度数据进行通断加热,使其温度始终维持在(37±0.5)℃范围内。控温过程采用位式控制技术并对温度范围分段,设定细胞培养液(25～33)℃为快速升温阶段、(33～36.5)℃为缓慢加热阶段、到达36.5 ℃时为保温阶段。有机玻璃薄板温度过高容易变形,并且传热路径有热损耗,因此在快速升温阶段,加热膜的表面温度被控制在60 ℃;在缓慢加热阶段,加热膜的表面温度被控制在45 ℃;在保温阶段,加热膜的表面温度被控制在42 ℃。由于液体具有一定程度的热惯性[11],达到保温阶段的液体还会有较小幅度的温升,所以温度控制下限为36.5 ℃。

体外培养人体细胞最适宜的pH范围为7.2～7.4[12],过酸或者过碱都会影响细胞的正常生长,因此需要控制培养体系的pH稳定在该范围之内。以每次加入0.02 mL pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline, PBS)、每隔5 min加入一次的策略,模拟细胞在扩增状态下乳酸的释放与堆积导致培养体系pH下降的过程,设置pH的控制下限为7.15,pH传感器的读数低于控制下限后,加入5 mL pH 7.5的PBS(模拟添加新鲜培养液),一方面使得培养体系的pH回升到适宜细胞生长的7.3左右,另一方面起到稀释细胞的作用,防止因为密度过大、营养物质匮乏而阻碍细胞的进一步扩增,整个实验过程中柔和振荡反应器,充分混合内部液体。

气体环境对于细胞的呼吸作用有着重要的作用。体外条件下,气体环境应该保持为5%CO2[13-14]+95%空气的混合气体状态。本实验使用CO2浓度传感器和阀门来控制反应器气体环境,当传感器读数低于设定值4.9%,下位机控制阀门11开启,释放5%CO2的混合气体进入反应器,更新气体环境。装有混合气体的气瓶经过减压阀、流量计降压降速至流速(0～100)mL/min,再经过阀门11连接到反应器的气体接头,阀门9常闭,CO2传感器安装在反应器内部,下位机采集CO2数据并据此控制阀门11通断以调节CO2浓度,当监测到传感器读数低于4.9%时,下位机控制阀门11开启3 s,当读数高于4.9%时,阀门11保持关闭状态。

充足的氧气供应是细胞进行呼吸作用的必要条件[15]。在CAR-T制备体系中,细胞的生长环境是培养液,因此需要监控培养液中DO浓度。在37 ℃的液体温度环境下,本实验使用DO传感器研究振荡过程对DO浓度的影响。本实验在静态条件下监测DO浓度,后以5 r/min的转速柔和振荡反应器,在动态条件下监测DO浓度,再重复一次上述静态-动态过程,采集DO浓度数值并绘制曲线图。

2.2 细胞过滤分离实验

CAR-T制备流程中需要多次清洗细胞产品,去除杂质成分。T细胞属于悬浮细胞系,粒径10 μm左右,本实验中使用粒径10 μm、密度1.05 g/cm3的聚苯乙烯乳胶微粒代替T细胞,测试基于8 μm滤膜过滤方案的分离效果。设x为稀释倍数,单个微球体积为V0,人体外周血中T细胞的密度a为2.4×109/L,乳胶微粒分散体系密度c为25 mg/mL,聚苯乙烯的密度ρ为1.05 g/cm3,微球半径R为5 μm,由浓度换算关系得:

(1)

其中:

(2)

得到x=18.958,取x=19。

根据上述计算得到的结果,将50 μL乳胶微粒悬浊液加入950 μL培养液中混匀,作为模拟PBMC悬液使用。将PBMC悬液泵入反应器的初始培养区;开启阀门3和9,泵入4mL培养液;开启阀门10,反应器内的液体通过8 μm滤膜泵出至细胞培养板中,标记为A1;打开阀门3和9,泵入适量的培养液,将残留在8 μm滤膜的细胞回流至反应器内。CAR-T细胞制备流程中, T细胞的清洗过程往往需要三次重复的清洗步骤,因此再重复两次上述操作,液体泵出至细胞培养板中,分别标记为A2、A3;最后向反应器泵入5 mL培养液,打开阀门9,泵出反应器内的所有液体至细胞培养板中,标记为A4,将细胞培养板放入恒温箱中干燥48 h,在200倍光学显微镜下拍照并计数微球数量,观察细胞过滤分离效果。

2.3 磁珠吸附固定实验

获取患者的PBMC之后,需加入特定抗体修饰的CD3磁珠以分选T细胞[16]。该过程有两个关键点:一是抗体修饰的磁珠能够准确识别T细胞并牢固结合,二是磁珠与T细胞结合后,外加磁场可以将磁珠牢固吸附在反应器底部,使其不会随着液体的流动而移动。磁珠与T细胞识别并结合后,一旦磁珠被吸附固定,相应的T细胞也就完成了分选的过程。

CAR-T细胞制备过程中常用的CD3免疫分选磁珠为直径5 μm的微球,微球表面偶联有CD3抗体以阳性分选CD3+T细胞[17]。与CD3免疫磁珠相似,SiO2磁珠具有超顺磁性,与CD3免疫磁珠有着相同的磁场行为,且两种磁珠的密度相似(1.7 g/cm3左右)。本实验中采用粒径5 μm的球形SiO2磁珠(百纳泰科,中国)代替CD3免疫磁珠。设y为稀释倍数,临床上的CD3/28免疫分选磁珠的浓度为1.7×108/mL,SiO2磁珠(百纳泰科,中国)的浓度为10 mg/mL,磁珠密度为1.82 g/cm3,磁珠半径为2.5 μm,按照与公式(1)、(2)相同的计算方法得出y=2。CAR-T制备流程中需要加入200 μL磁珠,根据上述计算结果,将100 μL SiO2磁珠悬浊液泵入反应器,开启阀门3和9,将4.9 mL培养液泵入反应器。静置30 s后,磁铁转位机构将条形磁铁转入反应器底部。充分吸附2 min后,开启阀门9,将液体泵入细胞培养板中,标记为B1。磁铁转位机构转出,开启阀门3和9,将5 mL培养液泵入反应器,柔和振荡反应器并向其中通入空气产生大量气泡(模拟吹打细胞操作以促进分散),打开阀门9,将反应器内的液体全部泵出至细胞培养板中,标记为B2。

3 结果与分析

3.1 培养环境核心参数监控实验

温度、pH、CO2、DO传感器读数曲线图如图4所示。从温度变化曲线可以看出,培养液一共分为6次加入,最终的液体体积量为400 mL。每一次加入液体的瞬间,液体温度有较大下降。控制程序及时响应使得液体进入快速加热阶段,液体立刻以较快速率升温;当液体温度高于33 ℃时,为了避免控温超调、减小液体系统的热惯性,进入缓慢加热阶段,最终维持在(37±0.5)℃的范围内,该温度范围是细胞增殖的最适温度范围。从pH变化曲线可以看出,初始液体是15 mL pH 7.5的PBS,由于外加pH 6.5 PBS的影响(模拟细胞在增殖过程中乳酸产生、堆积的过程)培养体系的pH会逐渐下降,当低于控制下限7.15时,反馈程序调节向反应器内补充5 mL pH 7.5的PBS,其作用一是使得pH回升至最适宜的7.2～7.4,二是起到稀释细胞的作用,防止细胞因过度密集、养料匮乏而阻碍进一步扩增。从CO2浓度变化曲线可以看出,初始状态下CO2浓度读数远低于目标值5%,程序控制气阀打开,CO2气体迅速进入反应器,并维持在5%的水平,当CO2浓度出现±0.1%的波动时,程序控制气阀自动开启以更换反应器内的气体,使CO2浓度始终维持在5%。从DO浓度变化曲线可以看出,在37 ℃的液体温度环境下,静态DO浓度处于比较低的4 mg/L水平;开始振荡(5 r/min)后, DO浓度会增加到接近6 mg/L的水平,并最终稳定在6 mg/L;停止振荡后,DO浓度又恢复为4 mg/L;再次开始振荡后,DO浓度仍会增加并保持稳定。说明对反应器的柔和振荡有利于提升培养液中DO浓度。

图4 培养环境核心参数监控曲线图

3.2 细胞过滤分离实验

细胞培养板A1、A2、A3、A4标记位置的显微观察照片如图5所示。

图5 A1、A2、A3、A4标记位置的显微观察照片

A1、A2、A3分别为CAR-T细胞制备工艺三次洗涤流程结束后废液中微球的显微照片,照片中微球数量越少,代表废液中残留的T细胞数量越少;A4为反应器内部液体中微球的显微照片,从照片中可以看出,微球密密麻麻铺满整个视野而且分布在不同焦平面层上,数量十分巨大。采用五点取样法对各个位置的微球密度进行计数,得到各标记位置的微球密度如表1所示。

表1 各标记位置的微球密度计算表/(个/ mm2)

由表1可以得出如下结果:

(1) 洗涤废液和反应器内液体的微球密度,有着数量级上的差别。经过三次洗涤过程,废液中所包含的微球密度总和约占反应器内微球密度的2.13%,反应器内微球占微球总数的97.91%。

(2) 洗涤过程中,随着洗涤次数的增加,废液中微球密度成倍数减少。

实验表明基于8 μm滤膜的细胞过滤分离结构配合液体回流方法能够实现T细胞与废液的充分分离。

3.3 磁珠吸附固定实验

细胞培养板B1、B2位置的显微照片如图6所示,照片显示废液中磁珠数量很少,只有零星聚集,而反应器内磁珠数量很多,在视野中呈分散式均匀分布,磁珠团聚较少。对比两张图片,可以看出废液和反应器中磁珠数目有着很大区别,并且反应器内磁珠分散较均匀,团聚现象很少出现。综上所述,条形磁铁的磁珠吸附固定方案能够有效地完成对T细胞的分选过程,并且在很大程度上避免磁珠团聚,增强磁珠的分散程度。

图6 磁珠显微照电

4 结论

本文研发了一套符合GMP规范的封闭式、自动化CAR-T细胞制备与监控原型样机,系统能够实现反应器内细胞培养液温度、pH、CO2浓度、DO浓度等核心参数的在线监测与调控;基于8 μm滤网的细胞过滤清洗方案和基于磁铁转位机构的磁珠吸附分选方案,能够实现对T细胞的分离清洗和免疫磁珠分选,除此之外该系统还具有物料自动定量添加、细胞收集等功能。

综上所述,本文所开发的全封闭、自动化CAR-T细胞制备与监控原型样机能满足CAR-T细胞制备的基本要求,应用于CAR-T细胞的自动化生产有广阔的前景。