基于数字微流控芯片平台进行动物源性成分快速初筛的应用研究

汪菊 王维霞 姜永莉 陈天蓝 梁誉斌 杨丁一 王苗苗 邹明强

（1．绵阳市产品质量监督检验所 四川绵阳 621050；2．中国检验检疫科学研究院；3．吉林国际旅行卫生保健中心；4.珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司）

0 引言

随着涮肉、烧烤、火锅的兴起，牛肉、羊肉、鸭血市场消费群体在快速扩大，但目前其产量远远达不到市场需求，肉制品、鸭血成为在食品生产、加工、流通及餐饮领域中造假掺假的主要目标[1-2]。 部分不法企业和商贩用低价肉或非肉成分冒充高价肉，在牛肉、羊肉、鹿肉等高价肉制品中掺杂鸡肉、鸭肉等低价肉及采用廉价的鸡血、牛血、猪血等动物血冒充鸭血，这些造假掺假的欺诈违法行为对人民健康、消费者权益、 市场公平交易机制及宗教信仰等造成巨大威胁[3-4]，已成为社会关注的焦点。

近年来，以蛋白质和核酸为基础的肉类掺假检测技术逐渐兴起，研究表明，利用免疫学方法可以定量地测定出动物源成分[5-8]。 其中微孔板ELISA 在定量靶标表征上有较高的精确度[9-10]。 Macedo-Silva 等[11]采用ELISA 检测法制作牛、马、猪、鸡蛋白的抗血清来鉴别汉堡中可能掺入的廉价肉类成分， 灵敏度为0.6%。 胡连霞等[12]研究发现，GNM C7-8 实时荧光PCR 检测法能够对同时添加4 类假肉的成分进行检测，使检测速率得到进一步提高。但这些传统的动物源性成分检测方法仍存在检测时间长、效率低、成本高等问题，难以满足批量大、操作简便、现场快速的检测要求。基于以上原因，建立一种快速、即时、高效、成本低且适于大批量样本的检测方法迫在眉睫。本文运用数字微流控芯片平台并结合聚合酶链反应法（PCR）对牛肉、羊肉、鸭血样品进行源性成分初筛检测，并与GB/T 38164—2019 和SN/T 2051—2008标准方法进行比对。

1 数字微流控芯片平台原理

1.1 环介导等温扩增技术LAMP （loop-mediated isothermal amplification）原理

为克服传统PCR 技术的反复升降温过程，数字微流控芯片平台应用了环介导等温扩增技术LAMP（loop-mediated isothermal amplification）技术，使实验过程快速、简便，仪器便携，检测结果特异性强、灵敏度高。

LAMP 扩增反应体系主要包括核苷酸、Bst DNA聚合酶、 引物组和含有镁离子的反应缓冲液。 Bst DNA 聚合酶由嗜硬脂芽孢杆菌中分离得到，具有链置换活性和5′-3′聚合酶活性的耐热DNA 聚合酶，但缺乏任何3′-5′外切酶活性，因此不会水解先前合成的DNA 链[13]。 LAMP 扩增一般需要4～6 个特异性引物， 靶向DNA 上有6 个不同区域（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c 和B3c）。 该组引物包括2 个内部引物，称为正向内部引物（FIP）和反向内部引物（BIP），而F3和B3 是2 个外部引物，也称为“置换引物”（图1，扩增过程使用恒温60～65°C 进行快速连续扩增，无需变性或退火）[14]。

图1 靶向DNA 的6 个不同区域（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c 和B3c）；正向内部引物（FIP），反向内部引物（BIP）；正向外部引物F3 和反向外部引B3Fig.1 Targeting six different regions on the DNA（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c and B3c），Forward inner primer（FIP），Reverse internal primers（BIP），Forward external primer F3 andReverse external reference B3

LAMP 反应分3 步完成， 即起初反应物模板合成、循环扩增及延伸和再循环。

1.1.1 反应模板合成阶段

内部引物FIP 和模板DNA 的F2c 区段结合，启动互补链的合成；F3 与模板链上F3c 区段结合，通过Bst 酶引发链置换反应，与模板DNA 形成双链结构，并释放内部引物FIP 置换合成的互补链；FIP 延伸单链5′端F1 序列以与F1c 序列碱基互补，形成茎环结构。

内部引物BIP 以与模板DNA 互补的FIP 延伸单链为模板，启动互补链的合成，形成双链DNA；B3插入双链DNA 中，与FIP 延伸链的B3c 区段结合，引发链置换反应， 释放出两端具有互补区域的DNA，形成哑铃状结构的起始反应模板[15]。

1.1.2 循环扩增阶段

哑铃型结构中，以F1 片段的3′端为起点，以自身为模板进行DNA 合成延伸。 同时，FIP 引物的F2与哑铃环上的单链F2c 杂交， 开始新一轮的链置换反应。 解离由F1 片段合成的双链核酸，解离出的单链核酸上会形成环状结构[15]。

1.1.3 延伸和再循环阶段

环状结构上有单链形式的B2c，BIP 引物上的B2 与其杂交，开始新一轮扩增。经过一系列放大，形成新的产物链和双链长度延伸的锤状结构， 并将以同样方式进一步延伸。随后的循环反应，茎的长度和环的数量逐渐增加， 最终产物是茎环DNA 的混合物， 即含有数个茎长度和椰菜花状结构的茎环结构（图2）[16-17]。

图2 反应物模板合成；循环扩增阶段以及延伸和再循环Fig.2 Reactant template synthesis；Cyclic amplification stages as well as elongation and recirculation

1.2 数字型微流控芯片结构及运行

本研究采用数字微流控Virus Hunter 检测设备及动物源性6 项成分核酸检测芯片试剂盒。

动物源性6 项成分核酸检测芯片的工作原理是： 当一个液滴覆盖2 个电极时， 其中一个电极通电，EWOD 力将液滴从未带电的电极拖到带电的电极上。 检测芯片结构如图3 所示，分为加样区、移液区、分液区和反应区。

图3 数字型微流控恒温扩增芯片结构示意图Fig.3 Structure diagram of digital microfluidic thermostatic amplification chip

待测样本核酸与扩增反应试剂的混合液从加样区通过电场驱动力移动至分液区， 再通过特殊的电极将液滴平均分成5 μL 体积，并移动至芯片反应区的反应点上与预存的检测试剂融合进行扩增反应。芯片的反应点上存储了检测目标动物源性引物检测试剂，不同反应点分別检测不同目标动物源性基因，因此能够同时对不同目标动物源性基因进行多靶点检测。 检测芯片的反应点通过发热丝加热给反应区提供热量至恒温扩增所需温度， 通过荧光读取检测信号，用于结果判断。

1.3 数字微流控芯片平台快速筛查检测原理

数字微流控芯片平台快速筛查检测是运用数字微流控介电润湿型液滴操纵技术，利用液滴在疏水化表面介电润湿现象，通过控制微电极阵列上液滴接触角变化，实现离散液滴精确控制。 该快速检测技术既有样品消耗量少、热转换快速的特点，又有高平行性和自动化功能，同时不依赖微泵、微阀或微混合器等元件，无需复杂的三维流体体通道，具有构建简单、可动态配置的优点。因此特别适用于高集成度、高性能、操作复杂的生物、化学微全分析体系，见图4。

图4 数字微流控芯片平台检测多种动物源性成分示意图Fig.4 Digital microfluidic chip platform for the detection of various animal-derived components process diagram

当检测点对应的曲线为S 型扩增曲线时， 则表示该检测点对应的待测结果为阳性； 当检测点对应的曲线无S 型扩增曲线时， 则表示该检测点对应的待测结果为阴性。 如图5 所示，该结果表明，猪动物源性成分、牛动物源性成分均为阳性，鸡、鸭、鹅及羊动物源性成分均为阴性。

图5 微流控芯片平台检测多种动物源性成分结果图Fig.5 Results of various animal-derived components detected by microfluidic chip platform

2 实验部分

2.1 仪器设备与材料

荧光定量PCR 仪（德国耶拿公司）；Virus Hunter检测设备（中检国研（北京）科技有限公司）；动物源性6 项成分核酸检测芯片试剂盒（鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊恒温荧光法，械检科技（北京）有限公司）；动物组织基因组DNA 快速提取试剂盒（含Buffer A、Buffer B 等，械检科技（北京）有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 样品准备

随机采购市售牛肉、 羊肉、 鸭血样品共100 批次，其中牛肉49 批次，羊肉20 批次，鸭血31 批次。

2.2.2 样品预处理

取样要求：对于整块组织样品，剪取样品的中心组织成分5～10 g；对于小切块的混合样品，选取若干小块样品，各切块分别剪取其中心组织1～2 g，混合各组分对于加工样品如肉卷、肉片、肉丸等样品，选取若干片/个组分，混合各组分；对于粉碎加工的肉沫样品，在样品5 个不同部位分别称取1～2 g，混合各组分。

均质处理： 使用均质机对上述样品进行破碎处理，转移破碎后的样品5 g 至无菌均质袋中，加入10 mL 生理盐水进行均质混匀。

2.2.3 基因组DNA 提取及检测

取均质处理后的均质组织20～30 mg，转移至离心管A 中，加入500 μL Buffer A，震荡混匀，80℃下热浴10～15 min。 热浴完成后，取10 μL 上清液至离心管B 中，加入90 μL Buffer B 进行中和混匀，中和后的液体即为DNA 溶液。按照动物源性6 项成分核酸检测芯片试剂盒（鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊恒温荧光法）使用说明书进行上机检测（于洁净环境下操作）。

3 结果与分析

3.1 数字微流控芯片平台快速筛查检测法

本实验共采购样品100 批次， 采用2.2 方法进行检测。结果显示，14 批次明示肉源结果的样品（牛肉3 批次，羊肉4 批次，鸭血7 批次）中，鸭血的阳性检出率为22.5%， 牛肉、 羊肉的阳性检出率分别为6.1%和20.0%， 且所有样品均未检测出鸡源性成分及鹅源性成分，具体结果见表1。

表1 14 批与明示肉源不符合的样品检测结果Table 1 Test results of 14 batches of samples that do not match the stated meat source

3.2 与实时荧光PCR 法对比

根据3.1 可知， 本次检测出的肉源性成分只有牛动物源性成分、羊动物源性成分、鸭动物源性成分及猪动物源性成分。因此，本文按照国家标准GB/T 38164—2019 《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR 法》[18]和SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法》[19]只对牛、羊、鸭、猪等4 种动物源性成分进行了确证检测实验。 其中，按照GB/T 38164—2019 方法对鸭、猪动物源性成分进行检测，按照SN/T 2051—2008 方法对牛、羊动物源性成分进行检测，具体检测结果见表2。 结果显示，其中有3 组样品检测结果有所差异，采用数字微流控芯片平台快速筛查检测法未在羊肉、羊肉串、羔羊肉片中检测出羊动物源性成分，而采用PCR 法检测羊动物源性成分结果为阳性。

表2 数字微流控芯片平台-快速检测法及实时荧光PCR 法的检测结果对比Table 2 Comparison of detection results by digital microfluidic chip platform-rapid detection method and real-time fluorescent PCR method

由表2 可知，数字微流控芯片平台快速筛查检测法经与实时荧光PCR 法检测结果对比，出现3 组结果偏差。 引起偏差的原因可能是数字微流控芯片平台快速筛查检测法与SN/T 2051—2008 检测方法的检出限有差异，快速筛查检测法与实验室确证检测法相比不够灵敏（见表3），具体原因有待进一步实验分析。 从总的对比数据来看，数字微流控芯片平台快速筛查检测法的大部分检测结果与实时荧光PCR 法吻合度较好，可用于样品中动物源性成分的快速筛查检测。

表3 不同检测方法的检出限Table 3 Detection limits of different detection methods

4 讨论

目前，牛肉、羊肉和鸭血的掺假问题仍很严重，随着人们对食品安全重视程度的提高， 确保动物源性成分真实属性的掺假检测越来越重要。 尽管已有多种各具特点的核酸分析新技术用于动物源性成分掺假检测，但建立一种低成本、快速筛查检测方法对市场掺假检测监管尤为重要。

数字微流控芯片平台快速筛查检测可同时对样品的鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊6 项成分进行检测，全程用时仅需45～60 min，具有成本低、自动化、便携性好、快速灵活、多靶标检测等优点。

为了验证数字微流控芯片平台快速筛查检测法的准确性和高效性，本文通过对市售牛肉、羊肉、鸭血（共计100 批次）样品进行快速检测，发现14 批次问题样品， 采用国家标准方法GB/T 38164—2019和SN/T 2051—2008 对问题样品进行确证检测，通过对2 种检测方法进行对比分析， 发现有3 组样品检测结果存在偏差。 引起偏差的原因可能是实验室确证检测法较快速筛查检测法的检出限更低。

实验结果表明， 数字微流控芯片平台快速筛查检测法具有快速、高效、成本低且适用于现场操作等特点，既能够实现大批量检测，又能保证检测结果的准确性， 可满足市场上动物源性成分快速筛查检测的需求。当然，数字微流控芯片平台在实际应用中也存在一定的局限性，例如，检出限指标尚未达到国家标准方法水平，上机检测对环境要求较高，有待于进一步研究完善。

5 建议及措施

5.1 对监管部门建议

（1）加强销售经营者监管。建议市场监管部门加强对食品经营者的许可证明及合格证明的监管，将动物源性成分掺假检测纳入监督抽检范围。 对抽检中发现的问题牛肉、羊肉及鸭血产品进行依法查处，逐级追溯，直至生产企业和源头。

（2）加强生产企业监管。建议加强对问题企业的监管力度，督促牛肉、羊肉及鸭血产品经营者进行自查自纠，规范进货渠道，主动索取并留存《动物检疫合格证明》等证明文件和进货凭证，同时建立食品安全追溯体系和诚信体系，严厉打击欺诈失信行为，确保食品质量安全。

5.2 对消费者购买和就餐建议

（1）建议消费者外出就餐时尽量选择大型正规和口碑较好的餐馆，不要一味追求价格低廉，避免食用假冒伪劣产品。

（2）消费者在购买牛肉、羊肉和鸭血等食材时，可先通过感官初步辨别真假。新鲜的羊肉呈较均匀的红色，有光泽，肉质坚而细，无异味；新鲜的牛肉呈暗红色，肌肉纤维很均匀，有光泽，外表微干，同时富有弹性，指压凹陷后立即恢复，具有牛肉特有的气味；鸭血呈暗红色，烹制后弹性较好，用水焯时不会掉色，煮熟后表面比较粗糙，且有少量不规则的气孔。