基于网络药理学探讨石菖蒲有效成分治疗神经退行性疾病的研究

王志芳 潘琪 张宾 徐展琼 方永奇 王南卜

神经退行性疾病(neurodegenerative diseases,ND)是一类由于大脑和脊髓的神经元细胞变性、丢失而引起的一类不可逆转的神经系统疾病,以发作迟缓和选择性神经元的功能障碍为特征,主要包括阿尔茨海默症(alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(parkinson’s disease,PD)和肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)[1]。现在对于ND以药物治疗为主,如多奈哌齐改善AD患者的认知功能[2];左旋多巴缓解PD运动功能障碍等[3]。天南星科植物的干燥根茎石菖蒲已经被证实对ND相关疾病具有缓解作用。石菖蒲及其挥发油对AD[4-6]和PD[7-8]模型动物都具有缓解症状改善病理状态的作用,通过分析石菖蒲中何种成分对ND的治疗发挥主要作用有助于推动石菖蒲治疗ND的机制研究。

本研究通过网络药理学原理筛选出石菖蒲治疗ND的主要靶点,结合已发现的石菖蒲中挥发油类物质是开窍醒神作用的主要有效成分[9]。探讨石菖蒲治疗ND的潜在分子机制与信号通路,为今后研究石菖蒲治疗ND提供更深层次的理论依据。

1 材料与方法

1.1 石菖蒲主要有效成分与靶点收集

以“Acorus tatarinowii Schott”为关键词,通过中药系统药理学TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)数据库(http:// ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、Pubmed和中国知网已发表的文献收集石菖蒲的有效成分与靶点。并筛选出符合口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,血脑屏障通透性(blood brain barrier,BBB)≥-0.3,类药性指数筛选(drug like index,DL)≥0.10条件的成分,导入TCMSP数据库获取相应靶点,并用Uniprot数据(https://www.uniprot.org/)以物种名称“Homo sapiens”为物种名称,筛选已经验证的靶点作为石菖蒲的有效成分或靶点。

1.2 神经退行性疾病靶点的收集

以“Alzheimer disease”“Parkinson’s disease”“amyotrophic lateral sclerosis”为关键词,通过geneCards(https://www.genecards.org/),OMIM(https://www.omim.org/),TTD(https://ngdc.cncb.ac.cn/)三大数据库收集疾病靶点,OMIM数据库和TTD数据库未设置筛选条件,gene Cards数据库设定相关性评分(Relevance score)>10为筛选靶点。整合以上数据库获得的靶点,将得到的靶点基因名称用Uniprot数据库转化成相对应的基因名称,合并去重得到ND最终相关靶点蛋白。

1.3 蛋白互作网络图构建

利用R语言获得石菖蒲活性成分靶点和ND靶点交集靶点的韦恩图,其共有靶点作为石菖蒲治疗ND的潜在作用靶点,借助String数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl),以物种为“Homo sapiens”,最小相互作用阈值为0.9作为条件,获得蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)关系后,通过Cytoscape_v3.8.0绘制PPI网络图。然后将PPI网络导入Cystoscape 3.8.0中,通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析,以degree, betweenness centrality,average shortest path length和closeness centrality这四个参数为参考标准,通过degree排序,选取分值大于2倍平均分的基因作为关键靶点,筛选出关键靶点,以横坐标为每个靶点的度值,将这些靶点使用R 4.0.3进行图片绘制。

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析

将石菖蒲和ND的交集基因列表导入String数据库,并应用R 4.0.3进行功能富集和主要通路分析。使用Bioconductor生物信息软件包,以P<0.05和qvalue<0.05为筛选条件,对关键靶点进行GO(Gene ontology)生物过程富集分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,将得到的结果用ggplot2包绘制成气泡图及柱状图。

2 结果

2.1 石菖蒲有效成分及靶点

通过TCMSP数据库平台检索得到石菖蒲有效成分105个,根据OB≥30%,BBB≥-0.3,OL≥0.10的筛选条件,获得有效成分24个。在Pubmed或中国知网检索得到的文献证实β-细辛醚(beta-asarone)、甲基丁香酚(Methyleugenol)、榄香素(Elemicin)是石菖蒲的重要成分[10]。因此,共获得石菖蒲活性成分27个,具体见表1。用Uniprot数据库将蛋白名称转换为基因名,得到靶基因43个。

表1 石菖蒲部分活性成分基本信息表

2.2 神经退行性疾病相关靶点

将geneCards,OMIM,TTD三大数据库收集得到AD、PD和ALS的疾病靶点合并去重后,分别为15357、658、204个,三种疾病合并去重后共收集基因15929个。

2.3 石菖蒲—活性成分—共同靶点—神经退行性疾病网络图

将石菖蒲有效成分靶点和ND靶点输入R语言的“Venn Diagram”包获得二者相关韦恩图(图1),获得交集靶点41个,获取候选化合物中与交集靶点相关的活性成分。将筛选后的石菖蒲的主要活性成分(表1)的MOLID及对应靶点数据导入Cytoscape_v3.8.0,生成石菖蒲可视化活性成分—靶点网络,网络节点包括石菖蒲、石菖蒲有效成分、ND及相关靶点,连线表示节点之间的联系。见图2。

图1 石菖蒲治疗ND的药物—疾病共同靶点韦恩图

图2 石菖蒲治疗ND的“药物—活性成分—共同靶点—疾病”

2.4 石菖蒲和神经退行性疾病靶蛋白相互作用的PPI网络图

将石菖蒲-ND的共有靶点借助String数据库,获得PPI网络,该网络中有41个节点,142条边,平均度值为6.93。将PPI进行拓扑分析,选取分值大于2倍平均分的基因作为关键靶点,以横坐标为每个靶点的度值,总共筛选出个18关键靶点,见图3。 将度值由高到低排序,其中原癌基因蛋白(Proto-oncogene c-Fos,Fos)、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinest-erase ,ACHE)、溶质载体家族6成员4(Solute Carrier Family 6 Member 4, SLC6A4)、肾上腺素能α1B受体(Adrenergic, alpha-1B-, receptor, ADRA1B)、肾上腺素能α2A受体(Adrenergic, alpha-2A-, receptor, ADRA2A)、单胺氧化酶B(Monoamine Oxidase B, MAOB)、前列腺素内过氧化物合酶2基因(Prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、肾上腺素能α1A受体(Adrenergic, alpha-1A-, receptor, ADRA1A)等的度值排名较靠前,见表2,提示这些靶点可能是治疗此类疾病的关键靶点。

图3 石菖蒲治疗ND的PPI网络图

2.5 石菖蒲与神经退行性疾病靶点的功能和通路富集分析

将石菖蒲治疗ND的潜在靶点进行GO 的生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、细胞组分(cell component, CC)富集,引用String数据库,将校正值P<0.05的项目进行筛选,交集靶点总共富集到364条生物过程,91项分子功能相关,43项细胞组成相关,并绘制成柱状图,见图4。结果表明,主要涉及到了前的有G蛋白偶联的胺受体活性、肾上腺素受体活性、儿茶酚胺结合、类固醇激素受体活性、神经递质受体活性、突触后神经递质受体活性等。

图4 石菖蒲治疗ND的潜在作用靶点的GO分析

将石菖蒲治疗ND的潜在靶点进行KEGG通路富集分析,引用String数据库,将校正值P<0.05的项目进行筛选,总共富集到28条信号通路,绘制成柱状图和气泡图,见图5。结果提示,神经活性配体—受体相互作用通路、钙信号通路、cGMP-PKG信号通路和唾液分泌通路富集到了较多的基因且其富集因子较高。

图5 石菖蒲治疗ND的潜在作用靶点的KEGG信号通路富集分析

3 讨论

ND的致病因素非常多样,现有药理研究阻断一个或两个途径不能明显减少神经元全面的功能障碍和损失。且此类疾病伴随的病理变化通常是不可逆的,在患者出现认知或运动障碍等临床症状时,病程往往已到中晚期,此时介入治疗不能从根本上逆转神经元的损伤。中医学认为ND属于中医“痴呆”“颤证”“偏瘫”等范畴,为本虚标实之证,病因主要因为各种致病因素导致痰浊上蒙清窍,当采用化痰开窍醒神的治疗方法。如ALS病因可由于外感温湿邪毒等致脏腑亏虚、肌肉筋脉失养[11]。王永炎院士认为气血亏虚,痰、浊和瘀是AD的病因[12]。现有研究发现,具有芳香开窍作用的中药对AD和PD等神经退行性疾病的治疗和基础研究,可以有效的改善患者症状的临床作用[13]。所以,在治疗方面应以清热化痰息风、活血化瘀息风为主。石菖蒲具有化浊祛痰、开窍宁神的作用,常用于ND的治疗。

在本研究的石菖蒲主要成分靶点和ND相关靶点中,交集靶点达到41个,提示石菖蒲治疗ND可能是多成分、多靶点共同作用的结果,如别香树烯、白菖油萜 、异紫花前胡内酯、佛手苷内酯、β-细辛醚、甲基丁香酚、榄香素等成分都具有开发成治疗ND药物的潜在市场。前期研究发现,从石菖蒲中提取的β-细辛醚可激活PINK1-Parkin介导的线粒体自噬而影响AD的病理,改善APP/PS1小鼠的学习和认知障碍[14],发挥快速抗AD的作用[15]。 在β-细辛醚对PD模型大鼠作用效果的研究中发现,当β-细辛醚联合左旋多巴可增PD大鼠的强纹状体中多巴脱羧酶表达及儿茶酚-O-甲基转移酶、酪氨酸羟化酶水平,提高纹状体中多巴胺水平,具有一定的神经保护作用[16]。

根据石菖蒲和ND的共有靶点预测主要涉及的基因蛋白有FOS、ACHE、SLC6A4、ADRA1B、ADRA2A、MAOB、PTGS2、ADRA1A等靶点可能是治疗此类疾病的关键靶点。现有研究发现,石菖蒲挥发油可抑制炎性痛大鼠L4～6段脊髓中细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和Fos表达[17],且海马、下丘脑FOS的表达可影响幼龄仔鼠空间学习记忆能力[18]。AChE和Aβ聚集抑制剂具有神经保护作用,可被作为治疗阿尔茨海默病的先导化合物[17]。SLC6A4的表达跟神经的生理功能关系密切[19],其表达异常会导致小鼠脑内5 -羟色胺的表达水平,从而影响小鼠的学习和记忆能力[20]。ADRA2B的一种常见遗传多态性导致位于该蛋白第三个细胞内环上的三种谷氨酸缺失,与情绪事件增强的记忆形成有关[21]。在交集靶点涉及的通路中神经活性配体—受体相互作用通路、钙信号通路、cGMP-PKG信号通路等信号通路中,主要涉及神经的传递和突触的结构和功能有关,影响记忆能力和运动能力[22]。

综上所述,本研究系统阐述了石菖蒲治疗ND的潜在物质基础和作用机制,为深入研究提供了相应的理论基础。我们后续会进一步对石菖蒲治疗ND相关疾病的成分筛查和靶点或通路的验证提供更多依据。