白术对复发性流产小鼠母胎界面辅助性T细胞及调节性T细胞的影响

余甜 杨小颀 马晓军 胥冰

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)在我国是指与同一性伴侣连续发生3次及以上的自然流产(流产发生于产妇孕28周前,且胎儿体重小于1 000 g)[1]。RSA病因复杂,且有半数以上的患者病因不明[2]。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)所分泌的白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)和调节性T细胞(regulatorycells,Treg)分泌的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)共同参与调节母胎界面免疫耐受状态的形成和维护[3],是RAS免疫致病因素中的重要影响因果。中药白术可影响体内免疫调节[4-6],中医学认为血气足以养胎,而脾为气血生化之源,中药白术为健脾良药[7]。故笔者从中医学角度推测白术可能通过健脾固摄、疗养气血安胎,并通过免疫学方法观察RSA模型小鼠母胎界面的免疫状态,深入研究白术对异常妊娠免疫的恢复和维持作用,从而佐证中药白术“健脾安胎”的理论。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取40只处于8周龄的清洁级CBA/J雌性小鼠、16只DBA/2雄性小鼠和4只BALB/C雄性小鼠作为实验模型动物,三种小鼠均购于南京卡文斯生物技术有限公司(由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部培育出售)。许可证号码:SCXK(沪)2018-0006。

1.2 主要药品及试剂

中药白术提取物购自西安德生元,7∶1水提;IL-17A及TGF-β1 ELISA试剂盒(上海艾莱萨,批号:EIA-2223;EIA-2747);兔抗小鼠CD4及大鼠抗小鼠FOXP3(Servicebio,批号:GB13064-2;GB13445);兔抗小鼠RORγt(Bioss,批号:BS-23110R)。

1.3 动物建模及分组给药

雌性CBA/J与雄性DBA/2小鼠按照2∶1比例合笼为复发性流产模型;雌性CBA/J与雄性BALB/C小鼠按照2∶1比例合笼为正常妊娠模型。10～12小时后检查,见阴道栓的CBA/J则直接判定为成功怀孕,未见阴道栓者取阴道分泌物进行染色镜检,见精子者与前者同判定为孕0天。后将受孕小鼠分为正常妊娠组、流产模型组及白术低剂量组、白术中剂量组、白术高剂量组,每组8只。白术灌胃量根据公式计算如下。见表1。

1.4 取材及指标检测

1.4.1 小鼠大体组织的观察及计算 各组雌鼠于孕14天行最后一次灌胃后处死小鼠(颈椎脱臼),观察阴道口是否出血。解剖暴露子宫后按照公式计算各组流产情况及胚胎吸收比例。右侧子宫组织加入对应量的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)(0.75 μg/mg,6倍于组织重量)后冷冻匀浆(4℃、2 000 rpm、20分钟),用于ELISA法因子含量测定;左侧子宫置入4%组织固定液中固定10小时,然后转入70%酒精中保存,用于石蜡包埋及切片染色。

1.4.2 HE染色对组织切片进行病理观察 将组织放入自动脱水机中梯度脱水,后放于2组二甲苯中各30分钟,再转入65°石蜡2小时,冷却后设定4 μm为厚度进行切片。染色:经二甲苯20分钟浸泡两组后,转入无水乙醇中浸泡5分钟,重复2组,再转入95%乙醇、90%乙醇和85%乙醇中各1分钟;苏木素3分钟,自来水冲洗1分钟,经分化液处理20秒后再次用自来水冲洗1分钟,再经返蓝30秒后自来水冲洗。85%乙醇和95%乙醇各5分钟浸泡,再用伊红染液染色5分钟,自来水冲洗杂余染料后无水乙醇浸泡5分钟,重复3组,二甲苯浸泡5分钟,重复2组,最终使用中性树胶封片后显微镜下观察。

1.4.3 ELISA法测定 按照试剂套盒说明书,检测小鼠子宫组织中IL-17A和TGF-β1细胞因子表达,操作完成后用酶标仪于450 nm波长处读取吸光度(optical density,OD)值,计算标准曲线公式,以获得对应细胞因子的含量。

1.4.4 免疫荧光双染法检测子宫组织内Th17和Treg细胞 取石蜡切片脱蜡后送入微波炉行抗原修复,后画圈封闭,孵育30分钟。两种细胞均先进行CD4染色,经一抗、二抗、FITC后,加热封闭。Th17细胞进行FOXP3核抗体染色,Treg细胞进行RORγt染色。后将自发荧光淬灭5分钟,冲洗,行DAPI染色。最后用PBS脱色,封片,使用荧光显微镜观察并采集图像,借助于图像处理软件Image J软件将原图片转为灰度图片,定量分析各图像中荧光信号强度,计算平均荧光强度。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组孕鼠大体组织观察与流产情况计算结果

各组孕鼠解剖后正常妊娠组的子宫胚胎完整连续,大小一致,排列紧密,串如椭圆珍珠,整体色泽红润,透过子宫壁可见深色胎盘紧贴子宫内壁。复发性流产组流产征象明显,子宫体积减小,见部分胚胎明显小于正常妊娠组,呈黑色或深血色,子宫整体颜色偏深呈淤血色,阴道口有不同程度出血。白术低、中、高剂量治疗组中被吸收的胚胎情况较复发性流产组有所缓解,胚胎流失较少,胚胎大小及发育情况较为正常。

经公式计算后得出复发性流产组流产率显著高于其他各组,白术给药各组流产率较复发性流产组有所降低。复发性流产组胚胎吸收率明显高于正常组(P<0.05);白术低、中剂量组胚胎吸收率均低于复发性流产组(P<0.05),而白术高剂量组与复发性流产组相比较差异不具统计学意义(P>0.05),却较正常妊娠组显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各处理组流产及胚胎吸收结果(鼠只=8)

2.2 各组孕鼠子宫组织HE染色光镜观察结果

下图中1A为正常妊娠组子宫,见内膜增厚且连续,形态结构完整正常,蜕膜细胞增多、排列规则正常,妊娠蜕膜化明显,子宫腺体及血管清晰可见,未见异常炎性细胞。图1B为复发性流产组子宫,见变薄断裂脱落的子宫内膜,蜕膜化程度低,蜕膜细胞数量少,排列杂乱模糊,有明显的坏死,可见血管异常出血。图1C1、C2、C3分别为白术低、中、高剂量治疗组子宫图片,与正常妊娠蜕膜化表现相似,图1C1可见排列整齐的蜕膜细胞,图1C2见蜕膜化和腺体增生同时存在、子宫内膜呈给药后的分泌反应,图1C3可见蜕膜与炎性细胞浸润,表明白术治疗组小鼠较正常小鼠仍存在一定程度的流产征象。

注:A为正常妊娠模型组,B为复发性流产模型组,C1为白术低剂量组,C2为白术中剂量组,C3为白术高剂量组。

2.3 各组孕鼠子宫组织中IL-17A、TGF-β1含量的比较

发性流产组子宫组织中的IL-17A含量明显高于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.01)。白术给药各剂量组与复发性流产组的IL-17A含量相比,前者均显著低于后者(P<0.01);其中白术低剂量组与白术高剂量组组间无差异(P>0.05),但均显著高于白术中剂量组(P<0.05)。复发性流产组中TGF-β1的含量与正常妊娠组相比较低(P<0.01)。白术低、中剂量组子宫组织中的TGF-β1含量高于复发性流产组,差异极明显(P<0.01),白术中剂量组的TGF-β1含量虽高于白术低剂量组与白术高剂量组,但各剂量组组间差异较小,不具有统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠子宫组织中IL-17A及TGF-β1的含量鼠只=8)

2.4 各组孕鼠子宫组织中Th17、Treg细胞荧光定量比较分析

荧光强度定量平均值比较中复发性流产组RORγt的荧光强度高于正常妊娠组(P<0.05)及白术各给药组(P<0.05),白术低剂量组和高剂量组显著高于中剂量组(P<0.05),但两组间无统计学差异(P>0.05);复发性流产组FOXP3荧光强度显著低于正常妊娠组(P<0.05),白术各给药组中高剂量组荧光强度虽高于复发性流产组,但无统计学意义(P>0.05);三种治疗剂量组相比较,白术中剂量组的免疫荧光强度为其中最高,且高剂量组与中剂量组间差异明显(P<0.05。详见表4。

表4 各组中子宫组织中RORγt和FOXP3免疫荧光平均光密度值鼠只=8)

3 讨论

复发性流产的患者通常在孕早、中期即会发生胚胎丢失的现象[8],其中包括早期因种植失败发生的生化妊娠。尽管现调查显示在妊娠妇女已至少有1%～5%会诊断为该疾病,但由于生化妊娠及人文等因素的存在,患病率可能远不止如此。本实验采用国际公认的自然流产小鼠模型CBA/J雌鼠×DBA/2雄鼠,胚胎吸收率可达36.49%[9-10]。本实验中RSA流产模型组流产小鼠所占百分比达62.5%(5/8),胚胎吸收率为34.6%(18/52),均显著高于正常妊娠组,且符合当前文献调查结果范围。本实验中白术中等剂量灌胃液根据人的临床常用白术剂量经公式转化而来,在三组中胚胎吸收率最低(10.5%,6/57),且相对流产模型组具有显著改善。说明中等剂量白术对复发性流产的治疗具有积极的改善作用,可能于胚胎种植开始抵抗小鼠先天流产倾向。

中药白术具有健脾功效,自古被称为“安胎妙药”,可从“健脾固摄,补气安胎”的角度治疗“滑胎”“数堕胎”[11]。《中华人民共和国药典》(2020版)指明白术具有胎儿保护作用,尤其在调节平滑肌收缩方面已然得到了实验数据证明[12]。中医治疗RSA依照“预培其损,辨证论治”原则进行。多项基于中医传承平台的数据挖掘中显示[13-14],无论在中医药古籍记载明方或是现代医者用方中,白术均排在“RSA用药频次表”前列,可见白术在中医药治疗RSA中的重要性和实用性。经过本次实验证明,白术单药给药后各组与流产模型相比均降低了胚胎吸收率,进一步证明白术可能在复方中起到重要作用,也为白术用于配伍提供了充足的理论依据。

Th17/Treg细胞之间的平衡对机体维持自身稳态是至关重要的。Th17细胞分泌促炎性因子IL-17A,与多种自身免疫性疾病的发生相关[15];而Treg细胞分泌TGF-β1、IL-10等细胞因子,有抗炎和维持免疫稳态的作用,在妊娠过程中增强母体免疫耐受并防止妊娠母体对胎儿的免疫排斥[16]。有研究表明Th17细胞可以介导炎症反应,并在功能上对抗Treg细胞[17];以IL-17抗体对自然流产小鼠进行治疗,胚胎流失率得到显著改善[18]。本实验通过ELISA方法检测子宫局部IL-17A和TGF-β1的表达可间接反应机体Th17和Treg细胞的水平。其中复发性流产组子宫局部IL-17A含量较高,其余各组相比都表现为显著增多的现象。白术给药后,IL-17A含量有所降低,说明白术可能通过影响Th17细胞分泌IL-17A功能或直接影响Th17分化,从而起到对抗流产发生的作用。白术中剂量组降低IL-17A的效果优于其他两组,表现为更好地促进妊娠效果。

近年来有研究发现,Treg与其他T细胞亚群相比分化更为复杂,在特定环境下可重新分化回Th细胞,并留有Treg细胞的免疫抑制功能特征。所以在FOXP3+Treg细胞中除起到本身控制免疫排斥的作用外,还可能存在Th1样、Th2样,甚至是与之功能相反的Th17样的调节性T细胞[19],提示我们应从更广更深的角度研究不同种Treg对于母胎免疫的影响。Treg细胞群对于成功怀孕的重要性已经在人类和动物模型中得到证实[20-21],且在RSA患者体内较Th17细胞变化更为显著,提示其对妊娠结局的影响更为重大。Treg细胞除了可以抑制炎症,防止母体对胎儿过度免疫外,还被证明在妊娠期间有助于调节母体血管功能,支持正常胎儿和胎盘发育[22]。本实验中,正常妊娠组TGF-β1表达含量远高于复发性流产组小鼠,白术给药后均比模型组有所上升,趋于正常妊娠组正常含量。三组剂量虽有不同,所得TGF-β1含量差异却无统计学意义。由此说明,白术可调控TGF-β1值由流产象趋于正常妊娠状态进行变化,在局部发挥促进免疫的作用。但由于TGF-β1来源及功能复杂,应进一步结合更特异性的检测方法来判定妊娠免疫时Treg的情况。

除此之外,本实验结合免疫荧光双染法,通过各细胞特征性表达的核转录因子RORγt、FOXP3来确定Th17和Treg细胞在母胎界面局部具体的分布情况。其中以RORγt平均光密度代表CD4+RORγt+Th17细胞的相对含量,FOXP3平均光密度代表CD4+FOXP3+Treg细胞的相对含量[23]。复发性流产组内RORγt荧光强度显著高于其他各组,FOXP3的荧光强度低于其他各组,尤其与正常妊娠组形成鲜明对比。白术各给药组RORγt荧光强度的情况与ELISA法分析IL-17A含量的情况一致,且两种方法对Th17的相对检测具有一致性,提示可用两种检测方法同时对RSA患者Th17水平进行检测,从而对疾病起到一定诊断作用;而对Treg而言建议进一步做详尽的分型检查,以确定Treg的分化与分泌情况。

综上所述,根据本研究的统计结果可知:对复发性流产小鼠模型进行不同浓度的白术干预后,其流产率和胚胎吸收率显著降低,这充分说明白术能够有效改善和预防复发性流产行为发生。白术在抑制Th17的同时,又能够刺激Treg的表达水平,使得耐受型免疫反应在母胎界面中占据优势,起到良好的固胎效果。