振腹法对多囊卵巢综合征大鼠血糖、胰岛素水平及p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白表达的影响

赵思雨 沈潜 付国兵 谢丹丹 李晶磊 李拓 赵峻嘹 齐恒 柏洁 耿楠

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一种常见的女性生殖代谢内分泌紊乱疾病,主要临床表现为肥胖、月经紊乱、高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、多毛、痤疮等,多发于生育期女性,发病率为6%～10%,是导致女性不孕的主要原因,会增加女性患心脑血管疾病、妇科疾病、2型糖尿病及远期并发症的风险,严重影响患者的生命质量、生育及远期健康。PCOS的发病机制尚不明确,因其临床表现及治疗疗效的高度异质性,目前对于该病的诊疗仍未达成共识,大多数医家认为本病由于下丘脑—垂体—卵巢轴功能出现紊乱导致。多囊卵巢综合征患者的一大特点是内分泌紊乱,有研究表明,PCOS患者有更高的血糖异常率[1],患糖尿病风险更高,性激素、胰岛素和血糖检测能够对多囊卵巢综合征的临床诊断提供非常重要的数据支持[2]。p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)主要参与细胞的分裂与增殖,在磷酸化过程中可促进其他胞质蛋白磷酸化,p38 MAPK可能是PCOS卵巢多卵泡发育的基础,研究表明,PCOS卵巢粒细胞较于非PCOS卵巢粒细胞中,磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 mitogen-activated protein kinase,p-p38 MAPK)表达量高[3]。振腹法是作用于腹部神阙穴的一种特色手法,研究表明,振腹法可以改善大鼠卵巢形态结构,降低性激素、炎症因子表达水平,对PCOS大鼠有一定治疗作用[4]。基于以上前提,本研究应用振腹法对PCOS模型大鼠进行干预,探究振腹法治疗对PCOS大鼠血糖水平的调节作用,及振腹治疗对p38 MAPK蛋白表达与卵巢形态结构的影响,为振腹法治疗PCOS的临床应用提供基础研究依据,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SPF级SD雌性大鼠40只,6周龄,体质量(180±20) g,性成熟,未交配,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,生产许可证编号[SCXK(京)20166-0006]。屏障环境下室内温度(23±1)℃,湿度(45±5)%,日光灯光照,普通清洁级鼠饲料饲养,自由饮用水。

1.2 主要试剂及仪器

实验试剂:来曲唑:0.25 mg/片×10片/盒(国药准字H19991001,江苏恒瑞医药股份有限公司),二甲双胍:0.5 g/片×20片/盒(国药准字H20023370,中美上海施宝贵制药有限公司),1%羧甲基纤维素钠溶液(Coolaber,批号:C9230),碱性美蓝染液(泰科美生物科技有限公司),0.01 mol/L磷酸缓冲盐(phosphate buffered saline, PBS),INS酶联免疫检测试剂盒(武汉云克隆有限公司,CEA448Ra),蛋白提取液(MDL,MDL91201),蛋白酶抑制剂(MDL,MD912893),BCA蛋白浓度测定kit(MDL,MD913053),SDS-PAGE预制胶套装kit(MDL,MD911919),中等蛋白分子量marker(Thermo,26617),p38(Bioss,bs-1640R),p-p38(Bioss,bs-5477R),二抗(MDL,MD932485),75%酒精,2%戊巴比妥钠。

实验仪器:电子天平、移液枪、血糖仪(强生稳豪)、血糖试纸(强生稳豪)离心机(恒诺仪器 AXTGL16M)、微量加样器(Gilson公司,法国)、电热恒温水浴槽(上海一恒恒温设备厂,HWS-24)、PVDF膜(0.22 μm)(Millipore,美国,ISEQ00010)、3MM 滤纸(Whatman,英国,3030861)、脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司,TS-100)、电泳仪(北京百晶生物技术有限公司,BG-subMIDI)、低温离心机(Sigma,德国,3-30K)、SDS-PAGE电泳系统(BIO-Rad,美国)、凝胶成像系统(UVP,美国,GelDoc-It310)、ChemiDoc MP化学发光成像系统(Bio-rad,美国,170-8280)、切片机(Leica RM2235)、石蜡包埋机(Leica G1150H)。

1.3 动物分组与造模

大鼠适应性饲养5天之后采用随机数字表法分为空白组、模型组、二甲双胍组、振腹组,每组10只。建立PCOS大鼠模型:选择芳香花酶抑制剂造模法[5],来曲唑以0.125 mg/mL的浓度剂量溶于1%羧甲基纤维素钠中,模型组、二甲双胍组及振腹组大鼠连续以8 mL/(kg·d)的剂量灌服21天;空白组等浓度等体积羧甲基纤维素溶液连续灌胃21天。

模型建立成功的评定标准[6]:(1)阴道涂片:观察大鼠阴道上皮细胞形态改变,监测动情周期。从造模第7天起直至造模第21天,每日上午8:00～9:00用生理盐水浸润的棉签在大鼠阴道内顺时针旋转1圈后抽出,将大鼠阴道分泌物顺时针旋转均匀涂抹于载玻片上,95%酒精脱水、固定后,用碱性美蓝染液染色5分钟,显微镜下观察上皮细胞形态。造模成功评价:涂片中上皮细胞持续1周以上以白细胞为主,未见阴道角化细胞,提示大鼠动情周期失常,且处于动情间期、无排卵。(2)血清T检测,造模第21天晚7点禁食12小时,次日早上每组大鼠各随机取1只大鼠处死,采腹主动脉动脉血,分离血清用于ELISA法检测血清T水平,取卵巢组织观察卵巢组织形态改变。造模成功评价:模型组、二甲双胍组、振腹组大鼠血清T较空白组均显著升高(P<0.05),卵巢组织较空白组出现多囊样改变。符合以上2项,可确定造模成功,每组保留9只。

1.4 干预方法

空白组及模型组大鼠自由饮食、饮水。二甲双胍组,实验第22天起予二甲双胍溶于1%羧甲基纤维素钠溶液,以二甲双胍43 mg/(kg·d),1%羧甲基纤维素钠溶液4 mL/(kg·d)的剂量灌服[7-8],连续给药15天。振腹组大鼠实验第22天起,同一操作者振腹手法干预,每只大鼠振腹治疗后休息5分钟后再进行下一只大鼠手法干预。具体干预操作如下:操作者左手固定大鼠,使大鼠腹部朝上,参照李忠仁[9]主编的《实验针灸学》选取神阙穴。根据类比法,人手中指指腹面积与大鼠前爪面积近似相等,故选取右手中指置于大鼠神阙穴,进行振腹法操作,每只大鼠每次操作15分钟,每天干预1次,连续干预15天。

最后1次干预后大鼠禁食12小时,腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg,大鼠昏迷后,腹主动脉取血4 mL,静置30分钟,放入多孔离心机中,3 000 r/min,4℃离心15分钟,取上清液注入一次性EP管内密封,-80℃冰箱保存;取双侧卵巢,眼科剪去除输卵管、卵巢表面脂肪组织及包膜,生理盐水冲洗后纱布吸拭表面水分,分别将双侧卵巢用4%多聚甲醛固定及-80℃冰箱保存。

1.5 检测指标

1.5.1 卵巢组织形态学观察 4%多聚甲醛固定的卵巢进行脱水、石蜡包埋、切片,制作HE染色病理切片,光镜下进行组织形态学分析。

1.5.2 空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、血清胰岛素(fasting serum lisulin,FINS)、胰岛素抵抗指数(homeostatic model assessment for insulin resistance,HOMA-IR) 取大鼠尾静脉血,血糖仪测定FPG,取大鼠血清,采用酶联免疫法测定FINS,严格按照试剂盒操作。

HOMA-IR=FPG水平×FINS水平/22.5

1.5.3 p38 MAPK蛋白表达 使用蛋白免疫印迹法对卵巢组织p38 MAPK蛋白表达进行测量。取大鼠卵巢组织,加液氮进行匀浆,加入1 mL PBS离心5分钟。吸干残留的PBS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,混匀,冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10秒),4℃低温离心机12 000 r/min离心15分钟,取上清液。利用BCA法检测蛋白总量。配胶、灌胶、上样、电泳操作。以甲醇活化的PVDF膜进行转膜,转膜后小心取出转移膜置于封闭液中,室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1小时。封闭后,加入一抗于4℃孵育过夜,用1×TBST洗涤PVDF膜3次,(室温下缓慢摇动洗涤)每次10分钟。将二抗用1×TBST稀释300倍;将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中(室温、避光缓慢摇动)作用60分钟。用1×TBST洗膜,洗去游离二抗。按1∶1(v/v)混合ECL试剂盒中两种液体;将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面,室温作用4分钟。抖掉膜上液体,将其放入化学发光成像系统成像。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢组织形态学观察比较

镜下观察各组大鼠卵巢组织切片,空白组可见正常卵母细胞、黄体,颗粒细胞层排列丰厚。模型组大鼠卵巢出现囊性卵泡,卵巢皮质间质细胞明显增生,颗粒细胞层数减少。二甲双胍组及振腹组大鼠卵巢形态与模型组相比,囊性卵泡减少,颗粒细胞层增厚,可见卵母细胞及少量黄体。见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织形态学观察(HE染色,×100)

2.2 各组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平比较

与空白组比较,模型组大鼠FPG、FINS及HOMA-IR明显升高(P<0.05),说明大鼠血糖水平升高,存在胰岛素抵抗。与模型组比较,二甲双胍组和振腹组大鼠的FPG、FINS、HOMA-IR水平显著降低(P<0.05)。二甲双胍组与振腹组相比较,FPG水平相近(P>0.05)。由此可见,振腹治疗可以改善PCOS模型大鼠FPG、FINS水平,对PCOS伴胰岛素抵抗有一定治疗作用,且降低FPG水平效果与二甲双胍相近。见表1。

表1 各组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比较

2.3 各组大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达水平比较

与空白组比较,模型组大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平明显较高(P<0.05)。与模型组比较,二甲双胍组和振腹组的大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平降低(P<0.05)。二甲双胍组与振腹组相比较,p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平相近(P>0.05)。由此可见,振腹治疗可以降低p38 MAPK、p-p38 MAPK表达水平。见表2,图2。

表2 各组大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白相对表达量比较

图2 各组大鼠p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表达量比较

3 讨论

根据PCOS的临床表现及特点,中医医家将之归为“月经后期”“月经量少”“闭经”“癥瘕”“不孕”等范畴。中医认为本病的病机主要与肾虚、脾虚、肝郁、冲任损伤、天癸失序、痰瘀胞宫有关,同时认为本病病因以肾虚为本。肾虚体现在肾阳虚和肾阴虚两方面。肾阳虚,肾阳不足,一则导致经血化生无力,二则肾的温煦作用无力,不能推动血脉正常运行,血脉艰涩难行,故可见月经后期、月经量少、闭经等症状。肾阴虚,肾精不足,胞宫不得滋养,卵子发育成熟能力减弱,不能按期增殖及发育成熟,故可见卵巢组织细胞多空泡而无成熟卵细胞,致患者无孕。肝郁脾虚,血液滋养不足,致冲任损伤、天癸失序,血海不能充盈,导致患者出现月经推迟、闭经乃至不孕。脾虚生痰,痰瘀互结于胞宫,可见卵巢多囊样改变;痰瘀泛溢四肢肌肤,致形体肥胖、多毛痤疮等PCOS典型症状症状。本病中医医家治疗多从肾、脾、肝论治。

振腹法治疗PCOS以调理肾虚为本,兼治脾虚、肝郁,同时调节冲任,推行气血津液,活血化瘀,重视先后天之本的调养与顾护。振腹疗法是臧福科所创立及其弟子三代人发展而来,主要手法掌振法是以医者手掌心劳宫穴正对患者腹部神阙穴,掌跟正对患者关元穴,中指对应患者任脉中脘穴,食指和无名指对应患者肾经,拇指和小指置于胃经,腕关节带动手掌指间关节在腹部进行频率为300～400次/分钟的振动;操作幅度小、压力适中、刺激量小,通过手与局部的共振传导至深层组织和远端,具有益气健脾、温阳散寒、和中理气、调理冲任、宁心安神、交通心肾等功效,临床中应用于内分泌、妇科、儿科、心血管等疾病的治疗并取得良好疗效[10]。神阙穴是振腹法治疗PCOS的重要穴位。神阙穴具有培元固本、温阳固脱、健脾益胃的功效,是神气通行之门户,先后天神气在此处交汇并藏于此处,并通过冲、任、督、带脉将全身经络联系在一起,为五脏六腑之本、十二经之根。通过振腹法刺激神阙穴,可激发肾中精气、调理脾胃、顾护胃气、畅通全身经络,达到治疗PCOS的作用。近年来,笔者将振腹法治疗用于PCOS临床治疗,取得一定疗效。

现代医学认为,多囊卵巢综合征,是一种多病因、多系统的女性生殖代谢内分泌紊乱疾病,主要临床表现为肥胖、月经紊乱、高雄激素血症、稀发排卵或无排卵、多毛、痤疮等,多发于生育期女性,发病率为6%～10%[11]。PCOS与血糖、胰岛素水平有密切关联。PCOS患者有更高的血糖异常率,多数PCOS患者存在血糖升高的情况[1]。有研究表明,高胰岛素血症和胰岛素抵抗对卵泡发育存在一定影响。PCOS高胰岛素血症使卵泡对卵泡刺激素的敏感性增加,反馈至垂体分泌的卵泡刺激素下降,导致卵泡提前闭锁,形成无排卵[12]。另有研究表明,胰岛素抵抗可以通过抑制肝脏合成胰岛素样生长因子结合蛋白,增加卵泡内膜细胞中的黄体生成激素,使非优势卵泡提前闭锁[13]。胰岛素抵抗亦可直接作用于卵泡颗粒细胞,抑制卵泡的生长发育,阻碍排卵发生[14]。p38 MAPK信号通路与PCOS的发生发展存在密切关联,p38是p38 MAPK信号通路参与细胞减数分裂、有丝分裂的重要信号蛋白[15],卵巢组织的p38 MAPK的磷酸化和过度表达会影响卵细胞的生长发育[3],促进卵巢的多囊样变。p38作为MAPK信号通路的信号转导分子,参与胰岛素多种靶向器官的能量代谢[16],有研究表明,卵巢p-p38 MAPK蛋白表达增加,导致PCOS胰岛素通路信号异常表达[17]。因此,p38 MAPK蛋白的表达与PCOS患者的发病、卵巢组织形态改变密切相关,同时影响PCOS患者血糖、胰岛素水平。

本研究结果显示,相比模型组大鼠,振腹组大鼠卵巢组织形态改善,FPG、FINS、HOMA-IR水平降低,FPG水平与二级双胍组相近,表明振腹治疗可以改善PCOS卵巢组织形态,调节PCOS大鼠血糖、胰岛素水平,改善PCOS模型大鼠的胰岛素抵抗状态。相比模型组大鼠,振腹组、二甲双胍组大鼠卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达量降低,说明振腹法可以改善卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平,进而改善PCOS症状;振腹治疗可能通过降低p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达水平,调节PCOS血糖、胰岛素水平,但其机制还需要进一步证明。

通过本研究,表明振腹治疗能够降低PCOS的FPG、FINS、HOMA-IR、卵巢p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平,改善卵巢组织形态,且在降低血糖的作用上与二甲双胍相近。二甲双胍是治疗PCOS的重要药物,可通过增加外周组织对葡萄糖的摄取利用,抑制肝糖异生和肠道葡萄糖的吸收,改善胰岛素信号转导,增加胰岛素敏感性等途径改善PCOS症状,PCOS伴胰岛素抵抗的患者推荐使用二甲双胍[18]。本研究为振腹法治疗PCOS提供一定的科学依据,为进一步探讨振腹调节p38 MAPK信号通路改善PCOS症状及血糖、胰岛素水平的机制提供研究基础。