牛源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

梁纤纤，李 威，郑启铭，李晓卓，张 凌，刘文锴，韩翔舒，苏战强，夏 俊*

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，乌鲁木齐 830000；3.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830000；4.农业农村部草食动物疫病防控重点实验室（省部共建），乌鲁木齐 830000；5.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832061）

犊牛腹泻一般包括病毒性腹泻、细菌性腹泻、寄生虫性腹泻。病毒性腹泻主要由轮状病毒、冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒导致；细菌性腹泻主要由沙门氏菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病毒导致，其中大肠杆菌是导致7日龄以下犊牛腹泻的主要原因，占发病原因的90%[1]。主要临床表现为腹泻、体温升高、排淡黄色稀粪、精神沉郁、脱水消瘦等，由于发病日龄过小，机体免疫力低，导致犊牛病死率很高，会给养殖业造成很大的经济损失。大肠杆菌是一种条件性致病菌，可引起犊牛腹泻、出血性肠炎等症状[2]。目前认为，大肠杆菌主要的黏附因子有K88、K99、F41等，其中F41菌毛是产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）主要的黏附因子[3]。2023 年3 月新疆某牛场犊牛发生严重腹泻，导致7 日龄以下犊牛死亡率达70%，本试验无菌采集犊牛腹泻粪便，采用分离鉴定、致病性检测和耐药性试验等方式对病原进行鉴定，以期为该牛场犊牛腹泻防治及给药方案提供理论依据，为新疆地区大肠杆菌病的拓展研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

采自新疆石河子市周边某牛场腹泻犊牛粪样，共20份。

1.1.2 主要材料

BHI 液体培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰氏染色试剂盒、DL2000 核酸Marker、200 μL 移液器、药敏纸片。

1.1.3 试验动物

18～22 g健康雌性BALB/c小鼠8只。

1.2 方法

1.2.1 样本处理

无菌采集2 g粪便，将粪便样品接种于BHI液体培养基中，37 ℃恒温过夜培养。

1.2.2 细菌分离

菌液过夜培养后，运用划线法将菌液接种于麦康凯琼脂培养基中，经过37 ℃恒温培养箱培养过夜后，挑取粉红色单菌落接种于6 mL BHI液体培养基进行纯化，置于37 ℃恒温摇床培养18 h并观察细菌生长情况。

1.2.3 染色鉴定

移液器取适量混匀的细菌培养液，按照革兰氏染色试剂盒的方法进行革兰氏染色，染色完成后镜检观察其形态。

1.2.4 细菌及毒力基因鉴定

使用大肠杆菌鉴定引物进行PCR 鉴定，经鉴定为大肠杆菌后再使用K88、K99、F41 毒力基因引物进行PCR 鉴定，引物序列见表1。反应体系为常规的50 μL 体系，瞬离后混合均匀置PCR 扩增仪中。反应条件为：95 ℃预变性3 min，然后94 ℃循环变性30 s，退火温度为58 ℃复性20 s，72 ℃延伸1 min，共进行30 个循环，72 ℃终延伸5 min，最后于4 ℃保存。配制1%琼脂糖凝胶进行电泳，参照DNA 2 000 Marker，判断产物的序列大小是否与目标值一致。PCR 扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果于NCBI进行BLAST。

表1 引物序列

1.2.5 药敏试验

采用K-B 纸片法对分离株进行药敏试验。移液器吸取200 μL 细菌培养液，均匀涂布于BHI 培养基上，待吸收10 min后，将药敏片（1μg/片）等距放置于培养基上进行药敏试验。于37 ℃恒温培养18 h后判定结果，药敏结果判定按CLSI标准。

1.2.6 致病性实验

试验组和对照组小鼠各4只，将细菌培养液浓度调整到8.86×109CFU/mL，试验组每只小鼠腹腔注射200 μL细菌培养液，对照组小鼠腹腔注射200 μL无菌PBS。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

细菌在麦康凯琼脂培养基上为边缘整齐，表面光滑的圆形或椭圆形粉红色菌落，见图1。革兰氏染色镜检可见单个存在的红色革兰氏阴性短杆菌，见图2。

图1 麦康凯琼脂培养基培养结果

图2 革兰氏染色镜检结果

2.2 细菌与毒力基因鉴定

进行大肠杆菌及毒力基因的PCR 检测后，结果显示有效扩增出大小为200 bp 和543 bp 的目的条带，见图3、图4，分离菌株为携带毒力基因F41的大肠杆菌。

图3 细菌大肠杆菌PCR鉴定结果

图4 细菌毒力基因PCR鉴定结果

2.3 致病性试验

试验组小鼠腹腔注射菌液4 h后，陆续开始出现精神沉郁、排黏液性粪便、被毛粗乱等症状，12 h后开始陆续死亡。对照组4只全程健康状况良好，无死亡现象。

2.4 药敏试验

药敏试验结果显示，该分离株对多黏菌素B、阿米卡星、头孢他啶、头孢哌酮、卡那霉素敏感；对青霉素、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、四环素耐药，见图5、图6。

图5 药敏试验1

图6 药敏试验2

3 讨 论

犊牛腹泻可根据发病情况不同，分为消化不良性腹泻以及传染性腹泻[4]。消化不良性腹泻一般病程短，防治有效且愈后良好，不会对养殖业造成太大经济损失。传染性腹泻是造成规模化牛场经济损失的主要疾病。传染性腹泻根据病原不同可分为病毒性腹泻、细菌性腹泻以及寄生虫性腹泻，其中细菌性腹泻的病原包括大肠杆菌、沙门氏菌以及产气荚膜梭菌等[5]。根据毒力因子、致病机理可以将致病性大肠杆菌分为五类，分别是产肠毒素性、肠出血性、肠致病性、肠侵袭性以及肠粘附性[6]。其中携带K88、K99、F41 以及F17 毒力基因的E.coli在患病动物中经常被分离出来[7]。本次试验从犊牛粪便中分离出的E.coli携带的毒力因子为F41，致病性试验显示该菌株对小鼠有一定的致病力。

本次试验检测到的E.coli对多黏菌素B、阿米卡星、头孢他啶、头孢哌酮、卡那霉素敏感，对青霉素、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、四环素耐药。杨艳丽等[8]研究发现新疆地区牛源E.coli对喹诺酮类药物诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星均产生不同程度的耐药性。许淑芸等[9]的研究显示石河子地区牛源E.coli对β-内酰胺类药物头孢唑林、阿莫西林、青霉素、头孢拉定等抗生素耐药性较高。郭庆勇等[10]的研究显示伊犁某牛场的粪源大肠杆菌不同生长阶段均对氨基糖苷类及β-内酰胺类药物耐药。本试验分离到的E.coli对喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素也表现为耐药，可能是由于该牛场疫病防治工作中抗生素的不合理使用导致细菌产生了耐药性。可根据本试验的结果改进抗生素使用策略，适量使用合适的抗生素来进行防治。

综上所述，致病性大肠杆菌是导致犊牛细菌性腹泻的主要病原，过去常使用抗生素来防治细菌性疾病，导致目前大肠杆菌对多种抗生素表现出不同程度的耐药性。应当根据发病情况改进抗生素的用药策略，不能盲目使用抗生素进行治疗，防治过程中尽量选择使用对菌株较敏感的抗生素，避免滥用抗生素。目前国内已研发出的疫苗有大肠杆菌灭活疫苗和大肠杆菌K99 灭活疫苗，通过注射大肠杆菌灭活疫苗以及大肠杆菌K99灭活疫苗，可以对大肠杆菌病进行有效防控。另外，换季时要注意畜舍通风，保持良好的卫生环境，出现腹泻病情时及时治疗并注意畜舍消毒。要始终坚持防大于治的原则。

4 结 论

此次从该牛场分离到一株携带F41毒力基因的大肠杆菌菌株，对小鼠有一定的致病力。通过耐药性分析得知该菌株对多黏菌素B、阿米卡星、头孢他啶、头孢哌酮、卡那霉素敏感，对青霉素、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、四环素耐药。建议该牛场通过本试验改进抗生素使用策略，合理用药防治犊牛腹泻。