单细胞转录组测序技术在动物生产中的应用

文│詹湉湉（福建省莆田市荔城区畜牧站）

单细胞转录组测序技术是对单细胞mRNA进行测序的技术，自2009年首次问世，期间不断发展，由于其能弥补传统高通量测序的局限性，对单个细胞进行无偏倚、高通量和高分辨率的转录组分析，逐渐成为测序领域最为关注的新技术之一。近几年，随着科技的发展和人们认识水平的不断提高，测序成本不断降低，测序技术的稳定性和测序通量持续提高，单细胞转录组测序技术被广泛用于解析肿瘤异质性、免疫微环境、神经系统及发育系统等复杂环境的研究，但在动物生产研究中的应用较少。

一、单细胞测序技术的优势

细胞是人体和其他生物体形态结构、生理功能和生长发育的基本单位，在生物体中起着极其重要的作用。Robert Hooke在1665年第一次使用“细胞”这个词来形容机体组成以后，细胞就成为大家关注的“焦点”。在二代测序（next-generation sequencing，NGS）还未兴起之前，人们一直使用传统的测序方法，这种传统的测序方法由于只能得到许多细胞的平均值，无法对少量细胞进行分析，它不能反映样品中所有细胞或者某群细胞特有的状态。但对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间也存在差异，同一个体细胞虽然具有基本相同的基因组，但其中每种细胞类型和细胞所表达的RNA却具有惟一性。往往会因为基因组或者转录组上的细微差异导致机体功能上的较大差别。而单细胞测序可以完美地解决这个问题，它可以检测单个细胞间异质性。也正是因为有了单细胞测序技术的出现，人们才能对组织中的单个细胞进行测序，获得单细胞水平的转录组或基因组图谱，对不同物种的细胞组成结构、细胞相似程度、标记基因的特异性和保守性等进行比较，解析单细胞的生物特性。

二、单细胞分离技术

从微生物培养菌落或病原微生物所感染的组织中分离出单个细胞是单细胞测序（Single Cell Sequencing，SCS）的第一步，是试验中极为重要的一个步骤。由于不同组织或者同一组织不同时期，其解离动力存在差异，因此，要成功获取细胞悬液并不是一项容易的工作，要根据不同的情况选择合适的获取技术，下面介绍一下目前常用的单细胞分离技术。

1.高通量分离技术。

（1）微流控技术（microfluidics）。微流控技术是指把生物学、化学等试验的基本操作过程集成到一块芯片上，该技术被人们形象地称为“芯片上的实验室”，其细胞培养方式分为“二维”和“三维”两种培养方式。微流控技术可以精确筛选细胞，具有高灵敏度、高通量等特点，为单细胞的研究开辟了新道路。

（2）荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activated Cell Sorting，FACS）。荧光激活细胞分选法是依据细胞表面特异性分子标志或细胞光散射的特性，通过流式细胞仪分选出单个细胞或某些特殊细胞群的技术。荧光激活细胞分选技术能特异性地分选细胞，具有精确度高、通量高、操作灵活等优点，是目前较为有效且经济的方法。

（3）免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting，MACS）。免疫磁珠分离技术是利用磁珠将细胞表面抗原与特定的单克隆抗体结合来快速分离目标细胞，这一技术广泛运用于分离基因、靶细胞及造血干细胞等。

2.低通量分离技术。

（1）有限稀释法技术（Limiting dilution）。有限稀释法技术也被称为连续稀释法，是根据细胞培养原理，将单细胞样本通过倍比稀释制成浓度不同的细胞悬液，是最简单、最粗糙的分离方式。该方法无需特殊装置，拥有相对独立性，操作简单方便、成本低等优点，但操作较为费时，容易丢失细胞，难以控制分离质量，不适合用于分离复杂的细胞样本。目前主要应用于不同组织的细胞克隆形成分析。

（ 2 ） 显 微 操 作 法 技 术（Micromanipulation）。显微操作法是结合高倍倒置显微镜，采用机械显微操作仪直接分离单个细胞的技术。该方法具有操作简单灵活、成本低等优点，但对操作人员的技术要求较高，且耗时长。一般适合少量样品的分离，如从造血干细胞、胚胎细胞或微生物中提取所需要的单细胞。

（3）激光捕获显微切割法技术（Laser Capture Microdissection，LCM）。激光捕获显微切割法是借助显微镜，利用激光从固定组织切片中准确分离、提取单个细胞的技术。该技术具有获取速度快、准确性高等优点，目前此技术较多应用于疾病研究、诊断中。

三、单细胞测序在动物生产中的应用

随着单细胞转录组测序技术的发展，越来越多的研究者开始将这一技术引入到动物生产研究中。

1.动物繁殖性能。动物繁殖力是指动物繁衍后代的能力，动物繁殖能力是衡量动物生产性能的重要指标之一，在动物生产经济效益中起主导地位，种畜的繁殖力直接影响生产力水平。睾丸发育、精子生成极大影响了雄性动物的繁殖能力，卵细胞的形成也是雌性动物繁殖的关键过程之一。利用单细胞转录组测序技术，通过特定基因从杜洛克公猪睾丸细胞中鉴定了20个细胞类群，发现一个未确定过的细胞类群，这一研究揭示了猪睾丸与细胞类型之间的相关性。通过分析鉴定了绵羊生殖细胞几个阶段特异性标记基因的研究，从4个不同的精原细胞亚群中分离、鉴定了未分化和分化精原细胞新的细胞表面标记物，分别是CD99和PODXL2。利用单细胞转录组测序技术从小鼠新生卵巢中分离提取出单个生殖细胞，经测序，将生殖细胞囊肿、卵泡、囊肿破裂等3种细胞状态分成3个细胞类群，这一发现为后续研究鉴定影响卵泡形成和发育的相关基因以及分子通路奠定了良好的基础。利用单细胞转录组测序技术从牦牛卵母细胞中识别鉴定出差异性标记基因，揭示了代谢通路在卵母细胞成熟过程中发挥着关键调控作用。单细胞转录组测序技术的出现与发展可以更精准地从精子发生和卵母细胞形成等过程中获得异质性细胞，可以对细胞参与的相关进程机制进行更加准确的解读，同时对其细胞不同发育阶段和动态变化有了更好地把握，也为提高动物繁殖力和治疗动物或人类的生殖疾病提供了参考。

2.动物生长性能。动物生长性能直接影响畜牧业的经济效益。由于单细胞转录组测序技术能解构复杂组织内的细胞异质性，对揭示器官、组织及胚胎发育过程的异质性具有很好的优势，现在越来越多的研究人员开始利用scRNA-seq对动物生长性能进行研究。人采用单细胞测序技术从绒山羊毛乳头细胞中成功获得17个主要细胞类群信息，经过基因差异表达分析，筛选获得SOX2、FGF7、APOD等绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因，该研究不仅证实了单细胞测序技术能准确、高效地鉴定出特异性基因，还为未来研究影响毛囊发育的相关基因及调控机制提供了更多可能，且对培育畜禽品种具有很好的理论指导作用。通过单细胞测序技术对天祝白牦牛生长期毛囊进行研究，成功从天祝白牦牛中鉴定出其生长期毛囊发育过程中涉及的表皮细胞、毛干细胞、角质细胞、真皮细胞、DP细胞、内根鞘细胞及伴随层细胞，并详细描述了毛囊发育的分化轨迹，揭示了天祝白牦牛生长期毛囊发育的异质性。何亭漪利用单细胞转录组测序技术对呼伦贝尔短尾羊和乌珠穆沁羊16天胚胎进行研究发现，呼伦贝尔草原短尾16天胚胎发育的细胞类群有8种，乌珠穆沁羊16天胚胎发育的细胞类群有13种。科研者还在短尾羊发育过程中筛选出TGF、Hippo、WNT等多信号通路共同协作调控尾部发育，并首次发现间充质细胞向脊索细胞转化是参与尾部形成的重要发育过程。

3.人畜共患病。因单细胞测序技术可以研究细胞特异性，能精准检测出原虫胞间的微小变异情况，该技术在寄生虫领域中也逐渐普及。借助scRNA-seq，通过数据集成、聚类和轨迹分析筛选出与蚊子中肠和唾液腺中疟原虫子孢子化过程密切相关的差异性基因。通过单细胞转录组测序技术对37和40℃条件下培养的疟原虫进行研究，揭示了疟原虫群体内部和细胞间异质性的变化，为深入研究致病机理和耐药性的出现机制提供了理论依据。

四、展望

随着单细胞转录组测序技术的发展，该技术已在人和动物为主的医学领域得到了广泛应用，相信越来越多的科研人员将利用单细胞转录组测序技术对动物生长和生产性能进行更深入的研究，筛选出控制优良性状的特异性基因，缩短育种进程，提高育种繁殖效率，实现DNA水平上的品种选育，为提高动物生长性能，增强机体免疫力，改善肉质品质，促进畜牧业高质量发展提供新思路、新技术。