SPE-HPLC法测定行气坦尼卡尔胶囊中东莨菪碱与莨菪碱含量

祝 婕 康汶铉 孟文全 尹 强， 穆丹丹

1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832000；2.新疆维吾尔药业有限责任公司，新疆 乌鲁木齐 830000

维吾尔药行气坦尼卡尔胶囊收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》维吾尔药分册第一册[1]，由芦荟、胡椒、硼砂、天仙子4味药材加工而成，具有行气、通便、止痛的功效，临床用于食欲减退、腹胀、便秘等症。天仙子(HyoscyamusnigerL.)为此方中重要组成部分，具有解痉止痛、定喘、安神的功效，主治胃痉挛疼痛、咳喘、癫狂[2]。东莨菪碱和莨菪碱[3-4]为天仙子的有效成分，同时也是毒性成分，能够有效阻断中枢M-胆碱能受体，抑制中枢神经系统，发挥镇静镇痛作用，但是过量服用会导致口干、吞咽困难、头痛、心动过速等毒性反应[5]，因此需对行气坦尼卡尔胶囊中此两种成分的含量进行有效控制。

行气坦尼卡尔胶囊现行标准中仅有芦荟苷和胡椒碱的薄层鉴别项，罗嫄等[6]建立了行气坦尼卡尔胶囊中药材的薄层鉴别方法及硼砂的含量滴定法，潘伟岑等[7-8]建立了该胶囊中芦荟苷、胡椒碱含量测定方法，但未见报道过行气坦尼卡尔胶囊中东莨菪碱与莨菪碱的含量测定方法。本文采用固相萃取高效液相色谱法(SPE-HPLC)建立行气坦尼卡尔胶囊中东莨菪碱与莨菪碱的含量测定方法，以期为有效控制该制剂的质量安全提供可靠依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Thermo Fisher Vanquish高效液相色谱仪(四元泵、在线真空脱气系统、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chromelon网络版在线工作站)；SK-250HP超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS205DU电子分析天平(常熟市佳衡天平仪器有限公司)；AL204电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；旋转蒸发仪RE-5205(上海亚荣生化仪器厂)；pH计PB-10[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；CNW poly-Sery MCX混合型强阳离子交换SPE小柱(150 mg，6 mL)。

A.阴性溶液；B.供试品溶液；C.对照品溶液 1.氢溴酸东莨菪碱；2.硫酸阿托品

1.2 药品与试剂 行气坦尼卡尔胶囊(新疆维吾尔药业有限责任公司，规格：每粒0.3 g；批号：220510，220509，220508，9211106，9211202，9210903，9190502，9190503，91904002，91904003)，行气坦尼卡尔胶囊阴性样品(新疆维吾尔药业有限责任公司，批号：XQ22022101)。氢溴酸东莨菪碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100049-201009，纯度91.7%)；硫酸阿托品对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100040-201613，纯度96.7%)；甲醇(色谱纯，Fisher Scientific USA)；乙腈(色谱纯，Fisher Scientific USA)；四氢呋喃(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；冰醋酸(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；结晶乙酸钠(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司)；石油醚(30～60 ℃)(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司)；娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：35 ℃；流动相：甲醇-乙腈-0.1%乙酸钠(含0.3%四氢呋喃，冰醋酸调节pH为6.40)(20∶40∶460)；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。理论板数按硫酸阿托品峰计算应不低于4000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取氢溴酸东莨菪碱对照品11.33 mg，硫酸阿托品对照品23.37 mg分别置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取对照品储备液适量于容量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含氢溴酸东莨菪碱45.3200 μg、含硫酸阿托品124.9000 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取行气坦尼卡尔胶囊，倾取内容物，精密称取5 g置于锥形瓶中。加入0.075 mol/L盐酸-甲醇100 mL，超声处理30 min(250 W，50 kHz)，室温下过滤，滤液减压浓缩至干。残渣加入0.1 mol/L盐酸20 mL溶解，过滤，取10 mL滤液加入已活化的固相萃取小柱(6 mL乙腈，6 mL水活化)，依次加入淋洗液10 mL水、10 mL甲醇、10 mL石油醚(30～60 ℃)，弃去淋洗液，依次加入5 mL乙腈∶浓氨(98∶2)，5 mL乙腈∶浓氨(95∶5)洗脱，收集洗脱液减压浓缩至干，残渣加入2 mL流动相溶解，0.45 μm滤膜滤过，即为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液制备 称取处方中不含天仙子的阴性样品，按“2.2.2”项下操作方法制备阴性样品溶液。

2.3 专属性考察 分别取阴性溶液、对照品溶液、供试品溶液注入色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进样，结果如图1所示。试验表明阴性样品无干扰，专属性良好。

2.4 线性关系考察 取1 mL中含有45.3200 μg氢溴酸东莨菪碱和124.9000 μg硫酸阿托品的混合对照品溶液，分别精密吸取0.8 mL、1.6 mL、3.2 mL、6.4 mL、8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀。按“2.1”项下色谱条件，依次注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得氢溴酸东莨菪碱回归方程为Y=0.1483X-0.0437(r=1.0000)；硫酸阿托品回归方程为Y=0.1729X-0.3048(r=1.0000)。结果表明氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品分别在浓度为3.6256 ～ 45.3200 μg/mL，9.9920～124.9000 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取质量浓度分别为14.5024 μg/mL、39.9680 μg/mL的氢溴酸东莨菪碱及硫酸阿托品混合对照品溶液，连续进样6次，结果氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的峰面积RSD分别为1.59%、1.59%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一样品(批号：220509)6份，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果测得6份样品中东莨菪碱及莨菪碱的平均含量(注：东莨菪碱含量=氢溴酸东莨菪碱含量×0.7894；莨菪碱含量=硫酸阿托品含量×0.8551)分别为13.5137 μg/g、44.2135 μg/g，RSD分别为1.79%、1.01%，表明此方法重复性良好。

2.7 中间精密度试验 由同一实验室A、B两位检验人员，在不同日期取同一样品(批号：220509)6份，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果东莨菪碱与莨菪碱含量RSD分别为4.91%、5.77% (n=12)，表明方法中间精密度较好。

2.8 稳定性试验 将制备好的样品(批号：220509)溶液于室温下保存，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h测定，计算氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品峰面积RSD分别为1.49%、1.71%，结果表明样品在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收试验 精密称取已知含量的行气坦尼卡尔胶囊(批号220509)6份，每份约2.5 g，精密加入适量氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果见表1和表2。氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品加样回收率均符合相关要求，表明该方法准确可靠。

表1 氢溴酸东莨菪碱回收率试验表 (n=6)

表2 硫酸阿托品回收率试验表 (n=6)

2.10 含量测定 按“2.2.2”项下样品溶液制备方法对10批样品进行含量测定。结果见表3。

3 讨论

天仙子在行气坦尼卡尔胶囊处方中占比为7.70%，东莨菪碱与莨菪碱含量之和在处方中占比约为0.00616%，且该处方中的胡椒含有大量生物碱成分[9]，对目标成分的含量测定产生较大干扰。本文建立的一种SPE-HPLC法，实现了东莨菪碱与莨菪碱的富集与分离，为行气坦尼卡尔胶囊的质量标准建立提供了参考，对于该品种的质量控制具有重要意义。

目前东莨菪碱与莨菪碱的含量测定方法多为有机溶剂提取-氨水碱化-三氯甲烷多次萃取[10-12]，造成严重环境危害和生理毒性。本研究采用的固相萃取技术避免使用三氯甲烷，极大降低了含量测定过程中的危险性，与已报道的方法比较，更加安全、灵敏、便捷。

本实验中对于提取溶剂浓度、物料比、超声提取时间、淋洗剂和洗脱剂的选择进行了考察，并确定了最佳提取条件。并且考察了DIKMA pro Elut PXC、Truserco SCX、Agela Cleanert Florisil等不同厂家和型号的固相萃取小柱，其中CNW poly-Sery MCX混合型强阳离子交换固相萃取小柱对目标成分的分离效果最好。该固相萃取小柱采用改性的苯乙烯-二乙烯苯共聚物作为基质，聚合物表面有亲水性和疏水性基团，对生物碱类化合物具有高度选择性。本方法采用混合型强阳离子固相萃取小柱分离了行气坦尼卡尔胶囊中东莨菪碱和莨菪碱两种托烷类生物碱，为该类化合物的分离检验方法提供了新的思路。