耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定

梁成真，臧有义，孟志刚，王远，MUBASHIR Abbas，何海焱，周琪，魏云晓，张锐，郭三堆

耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定

梁成真，臧有义，孟志刚，王远，MUBASHIR Abbas，何海焱，周琪，魏云晓，张锐，郭三堆

中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081

【目的】明确转基因耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性和营养品质等性状，为其产业化应用提供数据基础和技术支撑。【方法】针对实验室培育的新型耐除草剂棉花GGK2，选取其T3、T4、T5代开展试验研究。利用特异性PCR和Southern blot开展基因组整合稳定性分析；利用实时荧光定量PCR、ELISA和胶体金试纸条开展表达稳定性分析；通过田间喷施草甘膦测试其除草剂耐受稳定性，以及依据相关国际或国内行业标准进行棉籽营养成分分析等。【结果】抗除草剂基因和，以及筛选标记基因以单拷贝形式整合到棉花GGK2基因组D10染色体，且能够在T3、T4、T5代转基因棉花中稳定遗传，同时发现基因组中不含有遗传转化载体的骨架片段。表达分析发现、和3个基因在棉花GGK2的不同时期、不同组织部位均有表达，其中，叶片中的表达量相对较高。四叶期、盛花期、吐絮期3个蛋白在叶片中表达量分别介于128.7—192.4 µg·g-1、24.4—35.0 µg·g-1和17.0—23.9 µg·g-1鲜重，利用GR79 EPSPS单克隆抗体制备的胶体金试纸条可以对田间棉花GGK2叶片实现快速鉴定。除草剂耐受性分析结果显示，转基因棉花GGK2可耐受4倍生产使用剂量的草甘膦除草剂。T3—T5不同世代棉花喷施除草剂后均未发现受害症状，而且整个生育期的生长发育未受影响。棉籽营养成分分析表明，来源于新疆、河北和河南种植的GGK2棉籽中，水分、灰分、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素及脂肪酸含量与非转基因对照之间无显著差异，各指标的含量水平均位于ILSI数据库报道的范围内。【结论】转基因棉花新种质GGK2的耐除草剂性状遗传稳定性好、除草剂耐受能力强、籽粒营养成分与非转基因对照之间无显著差异，在耐除草剂棉花生物育种具有重要的应用价值且产业化前景好。

棉花；GGK2；耐除草剂；草甘膦；遗传稳定性

0 引言

【研究意义】国产转基因抗虫棉的成功应用，为棉花生物育种提供了重要的方向[1]。然而，与美国等发达国家相比，中国耐除草剂棉花研发和应用明显滞后，目前尚没有自主知识产权的耐除草剂棉花产业化应用[1-2]。团队前期培育了新型耐除草剂棉花GGK2，田间测试可耐受4倍以上生产用草甘膦除草剂的浓度[2]，具有较好的应用前景。因此，开展转基因棉花GGK2遗传稳定性研究，加快其转基因生物安全性评价对中国棉花产业“提质增效”具有重要的意义。【前人研究进展】杂草防治是农业生产中的一项重大难题。全球广泛分布的杂草有30 000余种，因适应性强，繁殖力旺盛，杂草造成的直接经济损失约占农作物总产值的13%[3]。杂草不仅与作物争夺水分和养分，而且滋生病害和虫害，严重影响作物的产量和品质，给农作物带来极大的危害[3-4]。中国农田杂草有580余种，其中，恶性杂草15种，主要杂草31种，杂草发生面积约9 000万hm2[5-6]。利用化学方法控制杂草省工且高效，已成为现代农业生产不可或缺的一部分[6]，各类除草剂的产量和年销售量已跃居农药之首。草甘膦是一种内吸传导型除草剂，作用于植物内莽草酸合成途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS），阻断植物芳香族氨基酸的生物合成途径，最终导致植物死亡[6-8]。草甘膦除草剂最初由美国Monsanto公司注册生产，由于其理化性质稳定、高效广谱、低毒低残留、环境安全，对大多数植物具有广谱灭生性，至今已在世界100多个国家生产使用，是目前生产上使用最广泛的除草剂[7-8]。自1996年Monsanto公司推出第一例商业化种植的转基因大豆品种GTS40-3-2以来，转基因作物种类已增加到10种左右、种植国家达到26个、种植面积扩大了100多倍[9]。目前，抗虫和耐除草剂性状是转基因作物商业化应用的主要性状，其中，具有耐除草剂性状的作物占全部转基因作物种植面积的80%左右[10-11]。商业化应用的耐除草剂作物主要通过将导入体内，从而获得草甘膦除草剂抗性[12-13]。近年来，中国耐除草剂作物研究取得了一定的进展，但是目前尚未进入产业化应用[2, 14]。棉花是重要的天然纤维作物，也是重要的油料作物，具有极高的经济价值[15-18]。中国既是棉花生产大国，也是消费大国，棉花对中国经济发展和农民增收具有重要的意义[19]。棉田杂草不仅严重影响棉花的产量和品质，而且增加了棉花生产投入，杂草防治投入约占棉花生产人工成本的20%[20-21]。新型耐除草剂棉花GGK2通过共表达2个不同作用机制的耐草甘膦基因和，进一步获得了高抗草甘膦、低残留的性状[2]。其中，GR79 EPSPS蛋白对草甘膦分子亲和能力低，可以克服除草剂的竞争性抑制作用，从而避免草甘膦除草剂对植物的致死效应[22]。GAT蛋白可以乙酰化草甘膦羧基形成无毒的乙酰化草甘膦，从而增强棉花GGK2草甘膦耐受性[23]。【本研究切入点】转基因生物安全性评价是基因工程产品商业化应用的必经之路，而遗传稳定性研究是转基因生物安全性评价的重要环节之一。【拟解决的关键问题】本研究详细分析转基因棉花GGK2不同世代的遗传稳定性，包括目的基因整合位点、基因表达、蛋白表达、草甘膦耐受性及籽粒中的营养成分等，为转基因棉花GGK2的产业化应用提供理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因受体品种柯字棉312（Coker312），以及T3、T4、T5代转基因棉花GGK2均由中国农业科学院生物技术研究所棉花分子育种实验室保存。用于基因整合稳定性、表达稳定性和草甘膦抗性稳定性分析的试验材料，种植于中国农业科学院生物技术研究所廊坊试验基地。用于测定营养品质的试验材料，分别种植于河北廊坊中国农业科学院生物技术研究所试验基地（2021年）、河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验基地（2021年）、新疆维吾尔自治区阿克苏中国农业科学院生物技术研究所试验基地（2021年）。

1.2 试验方法

1.2.1 特异性PCR检测 提取T3—T5代转基因棉花GGK2和对照材料柯字棉312的叶片基因组DNA，分别利用、、的引物和位点特异性引物进行PCR扩增（附表1）。棉花基因组提取参考文献[24]。

1.2.2 Southern blot检测 提取T3—T5代转基因棉花GGK2和对照材料柯字棉312的叶片基因组DNA，每个探针选择3种不同的内切酶酶切GGK2和柯字棉312基因组DNA，37 ℃完全酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳并转膜。探针、探针、探针和载体骨架探针引物见电子附表1，探针标记按照PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书进行。Southern blot试验按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ说明书进行操作。利用超灵敏多功能成像仪进行DNA杂交信号图像分析。

1.2.3 荧光定量PCR检测（qRT-PCR） 利用Trizol试剂法提取T3—T5代转基因棉花GGK2和柯字棉312的叶片RNA，取2 µg总RNA进行逆转录，反转录cDNA稀释10倍以后进行qRT-PCR[25]。qRT-PCR使用C1000TM Thermal Cycler （CFX96 real-time system, BioRad, USA）进行，采用Comparative Ct的方法处理数据。以为内参基因，每个基因进行3次重复。

1.2.4 ELISA检测 选取T3—T5代转基因棉花GGK2和柯字棉312四叶期、盛花期、吐絮期3个时期叶片进行总蛋白提取，每个组织3次生物学重复。样品经液氮研磨后，称量0.1 g样品加入1 mL样品提取缓冲液，同时，用2 mL样品提取缓冲液稀释标准品。使用北京华大蛋白研发中心有限公司生产的GR79 EPSPS和GAT蛋白抗体，检测GR79 EPSPS、GAT蛋白质的表达量。利用Thermo MK3酶标仪分析不同样品的吸光值，根据标准蛋白质的浓度及光密度值读数，拟合出标准曲线方程，计算各组织中GR79 EPSPS和GAT蛋白质的表达量。

1.2.5 草甘膦耐受性检测 依据《转基因植物及其产品环境安全检测耐除草剂棉花第1部分：除草剂耐受性抗除草剂棉花》（农业农村部公告第423号-14-2021），对转基因棉花GGK2的田间目标除草剂（草甘膦）耐受性进行检测。草甘膦除草剂施用量分别为农药登记标签中剂量的1倍（787.5 g·hm-2）、2倍（1 575 g·hm-2）、4倍（3 150 g·hm-2），按推荐时间施用。分别在用药1、2和4周调查和记录成苗率、植株高度和药害症状，药害症状分级参考GB/T19780.42。

1.2.6 种子营养成分分析 在河北廊坊、河南安阳和新疆阿克苏3个地区的试验材料中分别随机选取50株，收获中上部棉铃，对收获的棉花扎花、脱绒，将光籽烘干后粉碎，测定棉籽粉中的营养成分，包括水分、灰分、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素和脂肪酸，以及棉酚和植酸酶等含量。营养成分含量定义参考ILSI数据库。

1.2.7 数据统计分析 利用Excel软件进行数据整理，利用SAS 9.4数据处理软件进行数据分析，显著性分析采用成组法检验。

2 结果

2.1 转基因棉花GGK2特异性PCR分析

前期研究表明，棉花GGK2中T-DNA以单插入位点整合到基因组D10染色体（20 274 732— 20 274 752 bp）[2]，根据插入位点基因组左右边界序列信息，设计位点特异性鉴定引物（附表1）。目的基因PCR扩增结果表明，转基因棉花GGK2在T3、T4、T5代均可以检测到理论大小一致的和及筛选标记基因扩增条带（图1）。以上结果表明，转基因棉花GGK2中目的基因以单插入位点方式整合于基因组中并在转基因后代稳定遗传。

2.2 转基因棉花GGK2的Southern blot分析

分别依据、和表达盒序列设计特异性探针（图2-A），每个探针对应3种不同内切酶切割的棉花GGK2 T3、T4、T53个世代基因组，以遗传转化载体质粒为阳性对照。探针1选择dⅢ、RⅠ和HⅠ内切酶（图2-B），探针2选择RⅠ、Ⅰ和Ⅰ内切酶（图2-C），探针3选择dⅢ、RⅠ和I内切酶（图2-D）。Southern blot杂交结果表明（图2），探针1—3在棉花GGK2 T3—T5中均检测到一条特异性杂交条带，且T3—T5不同世代之间条带大小完全一致。相反，阴性对照柯字棉312未检测到杂交条带。以上结果进一步证明，转基因棉花GGK2中T-DNA以单拷贝形式整合到基因组且在不同世代间稳定遗传。

为了检测是否有植物表达载体骨架整合到棉花GGK2基因组，设计2个覆盖载体骨架的探针。Southern blot结果表明，棉花GGK2基因组DNA不存在载体骨架片段的插入（图2-E—F）。为了验证上述结果，进一步对棉花GGK2进行全基因测序分析，获得与Southern blot一致的结果。证明GGK2中、和组成的T-DNA以单拷贝形式整合到棉花基因组且不含有其他外源DNA片段。

GR79 EPSPS FP引物和RP引物理论扩增大小为645 bp；GAT FP引物和RP引物理论扩增大小为466 bp；NPTII FP引物和RP引物理论扩增大小为760 bp；RB FP+LB RP引物扩增片段大小810 bp；RB FP+LB RP引物扩增片段大小420 bp。Coker312：柯字棉312，作为阴性对照；DNA Ladder：DNA指示Marker；阳性对照：GR79GAT质粒。T3、T4、T5指转基因棉花GGK2 T3—T5代纯合株系。下同

A：限制性内切酶位点及特异性探针的位置。B：特异性探针1杂交结果。内切酶为HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ。C：特异性探针2杂交结果。内切酶为EcoRⅠ、NheⅠ和BamHⅠ。D：特异性探针3杂交结果。内切酶为HindⅢ、BamHⅠ和NheⅠ。E：特异性探针4杂交结果。内切酶为HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ。F：特异性探针5杂交结果。内切酶为HindⅢ、EcoRⅠ和BamHⅠ

2.3 转基因棉花GGK2中目的基因表达分析

qRT-PCR结果表明，转基因棉花GGK2根、茎、叶等组织均可检测到、和的表达，其中，叶片中表达量最高。对棉花GGK2 T3、T4、T5代四叶期进一步检测，发现在3个代际间均可检测到、和的表达，而且表达水平无显著差异（图3-A—C），进一步证明目的基因在转基因棉花GGK2不同代际之间表达稳定。

A：GR79 EPSPS；B：GAT；C：NPTII。不同小字母表示不同转基因株系之间的差异显著性（P＜0.05）。下同

2.4 转基因棉花GGK2中目的蛋白定量分析

ELISA检测结果表明，除了棉花纤维之外，T3、T4、T5转基因棉花GGK2的叶、根、茎、花蕾、花、棉铃和棉籽中的GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ蛋白均高效表达，且T3—T5转基因棉花中相同组织相同发育阶段表达量基本一致。研究还发现，叶片中目标蛋白含量显著高于其他组织，其中，四叶期、盛花期、吐絮期叶片中GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ蛋白含量范围依次为128.7—192.4 µg·g-1鲜重（GR79 EPSPS）（图4-A）、24.4—35.0 µg·g-1鲜重（GAT）（图4-B）、17.0—23.9 µg·g-1鲜重（NPTⅡ）（图4-C），同一蛋白在3个代际间含量无显著差异。相反，受体对照柯字棉312中未检测到3个蛋白的表达。同时，为了快速方便地鉴定转基因棉花GGK2，利用GR79 EPSPS抗体胶体金试纸条对田间棉花GGK2进行了快速检测鉴定，棉花GGK2及其衍生材料中均可以检测出目标蛋白表达，而未在对照柯字棉312检测到（图4-D）。

2.5 转基因棉花GGK2的草甘膦耐受性分析

草甘膦田间耐受性测试结果表明，转基因棉花GGK2在喷施生产用剂量1倍（787.5 g·hm-2）、2倍（1 575 g·hm-2）和4倍（3 150 g·hm-2）的草甘膦后，均未表现出受害症状，对照柯字棉312则全部死亡。尤其是喷施草甘膦除草剂2周和4周后，非转基因对照柯字棉312全部死亡，而T3、T4、T5代转基因棉花GGK2均正常生长，其株高、叶片受害率与喷施清水的GGK2对照组无显著差异，3个代际间草甘膦抗性表现稳定（表1）。因此，证明棉花GGK2的耐除草剂性状稳定遗传，可以满足生产应用的需要。

2.6 转基因棉花GGK2的营养成分分析

前期研究表明，转基因棉花GGK2的主要农艺性状和受体对照柯字棉312无显著差异，株高、果枝数、棉桃数、纤维品质和产量等性状在不同世代稳定遗传[2]。进一步分析T3—T5代转基因棉花GGK2的棉籽营养成分，结果表明，GGK2不同世代种子之间水分、灰分、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素E、维生素B2及11种脂肪酸含量基本一致，而且营养成分均位于ILSI数据库报道的含量范围之内（表2）。此外，与非转基因对照组柯字棉312相比较，棉花GGK2棉酚和植酸酶含量也未发生任何非预期和具有生物学意义的重大改变（表2）。

ELLS转基因棉花GGK2 T3、T4、T5代目的基因蛋白GR79 EPSPS（A）、GAT（B）和NPTⅡ（C）在四叶期、盛花期和吐絮期表达稳定性。D：转基因棉花GGK2 T3—T5代胶体金试纸条检测。箭头所示为目的条带。PC：阳性对照，NC：阴性对照

表1 T3、T4、T5代转基因棉花GGK2的草甘膦耐受性

表2 T3、T4、T5代转基因棉花GGK2营养成分分析

3 讨论

3.1 转基因棉花GGK2后代稳定遗传有重要的应用潜力

国产抗虫棉推广应用25年以来，中国基本解决了棉铃虫危害，棉花单产居世界前列，优质进程也明显加快[1]。近年来，草害上升为棉花生产的主要危害之一。杂草不仅与棉花争夺水分和养分，滋生病害和虫害，而且影响棉花产量和品质[14-15]。随着人工成本的提高，传统人工除草费用严重增加了棉花生产成本。因此，发展自主知识产权的抗除草剂棉花是中国棉花产业绿色可持续发展的重要环节。

转基因作物不同世代的外源基因DNA整合位点、基因表达、蛋白表达、目的性状以及营养品质等遗传稳定性分析，是转基因作物安全性评价的重要组成部分，也是商业化应用的前提[25]。转基因棉花GGK2中T-DNA包含2个目的基因（和）与一个筛选标记基因（）[2]，T-DNA片段以单拷贝形式整合到基因组。整合位点既没有破坏棉花内源基因，也未导致周围基因的表达变化，因此，未造成任何农艺性状的改变。本研究通过对连续3代严格自交的转基因棉花GGK2进行检测，结果表明，外源目的基因稳定地整合到棉花基因组中，而且目的基因的拷贝数、表达水平、蛋白表达量、除草剂抗性和棉籽营养品质等在3代之间无显著差异，证明了转基因棉花GGK2是一个高耐受草甘膦除草剂并且可以稳定遗传的新型抗除草剂生物育种材料，具有较好的产业化前景。

3.2 转基因棉花GGK2的后代性状稳定不存在安全风险

“多基因叠加”是增强抗性和防止抗性风险产生的重要手段[26-28]。转基因棉花GGK2中同时转入2个抗除草剂基因和，在双基因协同作用下棉花GGK2可耐中剂量4倍草甘膦喷施，而且农艺性状不受影响。由于GAT蛋白可以乙酰化草甘膦成为乙酰草甘膦，喷施除草剂15 d后转基因棉花GGK2叶片中草甘膦残留降低80%以上[2]，种子中检测不到草甘膦残留。除了棉纤维是重要的纺织原料，棉籽还是食用油和饲料的重要加工原料[15-16, 29-30]。对于非有意改变营养特性的转基因作物，营养成分分析是评估转基因过程是否造成任何非预期后果的“证据权重”的内容之一[31]。对转基因棉花GGK2棉籽进行了营养成分分析，结果表明，所有的营养成分均位于ILSI数据库报道的含量范围之内，因此，转基因棉花GGK2在成分、安全性、健康性和其他相关指标与目前种植、销售和使用的棉花实质等同。

抗虫和抗除草剂是转基因技术在农业生产上最成功的2个应用案例[21, 32]。草甘膦自1971年诞生以来，年消耗量约8亿kg，成为全世界第一大除草剂[7-8]。目前，全球80%以上的转基因作物是抗除草剂品种，抗除草剂作物在美洲国家广泛种植[33-34]。中国抗虫棉技术应用全球领先，成为生物技术在农业生产中成功应用的一面旗帜[21]。近年来，人工除草成本的上涨严重增加了棉花生产成本[35]。同时，自主知识产权抗除草剂棉花研发和商业化应用滞后成为我国棉花生产中的重要短板。转基因棉花GGK2的成功研发和应用，将加快我国棉花抗除草剂育种进程。此外，抗虫棉在中国推广种植以来，已培育200多个的高产优质抗虫棉品种[21]，未来育种家可以利用这些品种和抗除草剂棉花GGK2有效地开展联合育种，快速培育抗虫抗除草剂优质高产棉花新品种。而且抗虫棉的大面积推广种植，使得棉花转基因技术形成了较好的群众基础，将有利于抗除草剂棉花的商业化推广应用。

4 结论

转基因棉花GGK2的外源基因以单拷贝形式整合到棉花基因组中并在不同代际间稳定遗传。其中，2个目的蛋白GR79 EPSPS和GAT以及筛选标记蛋白NPTⅡ在植株不同时期、不同组织部位均有表达，且在叶片中的表达量相对较高。转基因棉花GGK2可耐受田间使用中剂量4倍的草甘膦除草剂，而且不同地点和不同代际间GGK2农艺性状和棉籽中营养成分没有显著差异。表明转基因棉花GGK2分子特征、农艺性状和营养成分等遗传稳定，是棉花生物育种重要的种质资源。

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Identification of Target Traits and Genetic Stability of Transgenic Cotton GGK2

LIANG Chengzhen, ZANG Youyi, MENG Zhigang, WANG Yuan, Mubashir Abbas, HE HaiYan, ZHOU Qi, Wei Yunxiao, ZHANG Rui, GUO Sandui

Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【Objective】The objective of this study is to confirm the target traits and genetic stability of transgenic glyphosate- resistant cotton GGK2 and provide technical support for its commercialization.【Method】T3, T4, and T5transgenic cotton plants GGK2 were subjected to insertion site-specific PCR, Southern blot, ELISA, bioassays in the laboratory and field, analysis of target herbicide tolerance, and investigation of nutritional constituents.【Result】The results indicated that the target genes, GR79 EPSPS and GAT, were integrated into the cotton genome as single copies and stably inherited in GGK2 plants. In GGK2 cotton,,, andproteins were expressed at different stages and in different tissues, with relatively high expression levels in the leaves. At the four-leaf stage, bud stage and boll opening stag, the expression levels in leaves were 128.7-192.4 µg·g-1, 24.4-35.0 µg·g-1, and 17.0-23.9 µg·g-1fresh weight for,, and, respectively. In the field, transgenic cotton GGK2 tolerated up to four times the recommended medium dose of glyphosate application. No significant differences were observed in agronomic traits and nutritional constituents compared to the control, Coker312.【Conclusion】These data demonstrate that transgenic cotton GGK2 is genetically stable and highly resistant to herbicides. Therefore, it can be utilized for breeding high-glyphosate- resistant commercial cotton varieties.

cotton; GGK2; herbicide tolerance; glyphosate; genetic stability

2023-01-17；

2023-02-23

国家重大科技专项（2016ZX08005-004）、国家自然科学基金（32072115和31771850）、中国农业科学院科技创新工程

通信作者梁成真，E-mail：liangchengzhen@caas.cn。通信作者张锐，E-mail：zhangrui@caas.cn。通信作者郭三堆，E-mail：guosandui@caas.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.002

（责任编辑 李莉）