固态发酵条件对纳豆激酶活性的影响及发酵条件的优化*

王 刚 ,王芝玉 ,安荣荣 ,滕玉婷 ,古 梅 ,刘 霞 ,高慧娟,3,董瑞丽

（1.攀西钒钛检验检测院，四川 攀枝花 617000；2.河西学院生命科学与工程学院，甘肃 张掖 734000；3.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000）

纳豆激酶 (Nattokinase) 来源于传统发酵食品——纳豆，纳豆中含有丰富的纳豆激酶，具有高效的溶栓作用[1]，很好的稳定性[2]，疗效不会受人体的胃肠等特殊环境影响。纳豆激酶在人体内的半衰期较长，无需大量服药，由于其特殊的溶栓机理[3-4]，病人服用后不会引发体内出血现象。由于目前市场上销售的溶栓剂如尿激酶、链激酶重组纤溶酶原激活剂等存在半衰期短、副作用大与价格昂贵等缺点[5]。纳豆激酶生产成本较低，安全性好，具有开发为新一代溶栓药物的潜力[6]。

目前纳豆激酶的生产方法主要通过液体深层发酵等获得[7]。具有发酵周期短、易于控制发酵条件的优点，但是成本高，污染大，现在逐渐被固态发酵技术取代。固态发酵具有生产成本低、设备简单、产酶活力高、易推广的优点[8]。通过A、B 两株纳豆芽孢杆菌在黄豆固体培养基产酶活性的研究，获得最佳发酵条件，旨在为固体发酵生产纳豆激酶提供一定的理论依据[9]。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

A、B 纳豆芽孢杆菌均由河西学院生命科学与工程学院微生物实验室提供。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 仪器

HH-S28s 恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂；V-1200 型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；AL104 电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；S70-CJ-18u 洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50FBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；ZHWY-200B 恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；FSD-100SA型电动粉碎机，台州市新恩精密粮仪有限公司。

1.2.2 试剂

酪蛋白分析纯（上海化学试剂厂），钨酸钠、铂酸钠、浓盐酸、硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯。

2 实验方法

2.1 福林-酚试剂配制方法

称 取50 g Na2WO4·2H2O、12.5 g Na2MoO4·2H2O，置于1 000 mL 圆底烧瓶中，加350 mL 水、25 mL85%磷酸、50 mL 浓盐酸，文火微沸回流10 h，取下回流冷凝器，加50 g Li2SO4，25 mL 水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15 min，驱除残余的溴，冷却，用水稀释至500 mL 备用。

2.2 菌种活化

将A、B 两种纳豆芽孢杆菌粉接入新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于38 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，再转接至液体培养摇瓶中，在震荡培养箱38 ℃培养24 h，配置为107CFU/mL 的菌悬液，置于4 ℃冰箱中备用。

2.3 纳豆制备工艺

精选黄豆→清洗→浸泡→高压蒸煮(121 ℃，30min)→晾置→接种→发酵→成熟纳豆

①精选黄豆。选用颗粒饱满、大小均匀、蛋白质含量高的市售黄豆。②称重清洗。每份称取20 g，用清水冲洗。③浸泡。用1.5 倍的蒸馏水浸泡24 h，室温，沥干水分。④灭菌。把浸泡好的不同粒度的大豆装入250 mL 的锥形瓶，包扎，在121 ℃下灭菌30 min。⑤接种。将灭菌的锥形瓶放在自然条件下晾置至30 ℃左右，在无菌条件下接入纳豆杆菌，摇匀，使纳豆芽孢杆菌充分与黄豆接触。⑥发酵。放入38 ℃培养箱培养一定时间后，即为纳豆。

2.4 粉碎方式对纳豆激酶活性的影响

精选黄豆，洗净、浸泡过夜，除去多余水份后，将黄豆的整粒、1/2 粒、1/4 粒、1/8 粒和粉末50 g，分别置于250 mL 的锥形瓶中，在121 ℃灭菌30 min，自然冷却，按固体培养基重量的9%比例接种A、B 两种纳豆芽孢杆菌菌液，在38 ℃下培养48 h，每种粉碎方式做3 次平行，将发酵好的纳豆研碎，加入缓冲液提取粗酶液，测定纳豆激酶的活性，以确定最佳的粉碎方式。

2.5 接种量对纳豆激酶活性的影响

在250 mL 锥形瓶中，加入50 g 浸泡过夜的黄豆，包扎，在121 ℃下灭菌30 min，待其冷却至30 ℃后，接入A、B 两种纳豆芽孢杆菌菌液，按固体培养基重量的5%、7%、9%、11%和13%接种量分别接种，每个平行设定3 次重复。置于38 ℃的培养箱中，培养48 h 后取出，将发酵好的纳豆研碎，加入缓冲液提取粗酶液，测定纳豆激酶的活性，以确定最佳的接种量。

2.6 发酵时间对纳豆激酶活性的影响

在250 mL 锥形瓶中，加入50 g 浸泡过夜的黄豆，包扎，在121 ℃下灭菌30 min，待其冷却至30 ℃后接入A、B 两种纳豆芽孢杆菌菌液，按固体培养基重量的9%接种量接种，放在培养箱中培养，在培养箱中分别培养12、24、36、48 和60 h 后，每个培养时间3 次重复，将发酵好纳豆研碎，加入缓冲液提取粗酶液，测定纳豆激酶活性，以确定最佳发酵时间。

2.7 纳豆杆菌发酵黄豆产酶活性的正交实验设计

在单因素实验基础上，为了获得纳豆杆菌产酶活性最高的工艺条件，采用Box-Behnken 实验设计方法，以粉碎度、接种量和发酵时间为变量，分别以A1、B2和C3表示，并以-1，0，1 分别代表变量的水平，以测得提取液酶活性(Y)为响应值，通过响应曲面分析进行制备条件的优化，从而得到最优发酵条件。Box -Behnken 设计实验因素和水平见表1，采用Design Expert 软件对试验数据进行回归分析。

表1 Box-Behnken 设计实验因素与水平

2.8 纳豆激酶活性的测定方法

2.8.1 粗酶液的提取

准确称取1.00 g 纳豆，放入酒精消毒后的研钵中研磨，研成糊状物后，加入50 mL 的pH 7.2 磷酸缓冲液，用水定容至200 mL，于常温下浸取30 min，随时摇动，在5 000 r/min 下离心10 min，取上清液，即为粗酶提取液。

2.8.2 水解液的制备

取1 mL 的1%酪蛋白溶液，于40 ℃水中预热5 min，加1 mL 粗酶液，于40 ℃水中反应20 min，加2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液，于40 ℃水中沉淀10 min，在5 000 r/min 下离心10 min 后取上清液为水解液。

空白液先加2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液，后加1 mL 的粗酶液，其余操作同上。

2.8.3 酶液比色测定

取5 mL 的0.4 mol/L 碳酸钠溶液，加1 mL 水解液，最后加1 mL 的1∶3 稀释的福林-酚试剂，于40℃水浴20 min，以不加酶液为空白，在680 nm，1 cm比色皿，V-1200 型分光光度计测定光密度。

2.8.4 酶活力的计算

蛋白酶活力的定义：在30 ℃，pH 7.2 的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1 μg 为1 个酶活力单位。

式中：E 为样品吸光度，K 为吸收系数，4 为水解液总体积，mL；10 为反应时间，min;N为稀释倍数，W 为纳豆取量,g；吸收系数K 值取100 μg[10]。

3 结果与分析

3.1 粉碎方式对纳豆激酶活性的影响

在不同颗粒度的固体培养基上接种9%的A、B两种纳豆芽孢杆菌后，38 ℃下培养，产生的纳豆激酶活性随着颗粒度粉碎度的增加，出现降低的趋势，变化不大，在黄豆为整粒时，两种菌产生的激酶活性最大，分别为836 U/g 和920 U/g，较徐强[11]用液体发酵法得到的纳豆激酶酶活720.7 U/g 分别高出15.9%和27.6%，结果见图1。

图1 粉碎方式对纳豆激酶活性的影响

3.2 接种量对纳豆激酶活性的影响

在黄豆固体培养基中接入发酵后的A、B 两种菌种，随着接种量的增加，纳豆激酶活性先增加，后出现下降的趋势，在接种浓度为9%时，A、B 两种菌液产生的酶活性最强，分别达到852 U/g 和1 128 U/g，其中B 菌种产生的酶活性比A 菌种高32.3%，确定9%为两种菌产生纳豆激酶的最佳接种量，并且B菌种在相同接种浓度下的产酶活性比A 菌种高，结果见图2。

图2 接种量对纳豆激酶活性的影响

3.3 发酵时间对纳豆激酶活性的影响

在黄豆固体培养基质量一定时，随着发酵时间的增加，纳豆激酶活性呈现先缓慢增加后急剧下降趋势，当发酵时间为48 h 时，A、B 两种菌种的产酶活性最强，分别为1 140 U/g 和1 448 U/g，B 菌种的产酶活性比A 菌种高27%，确定48 h 为两种菌液产生纳豆激酶的最佳发酵时间，并且得知B 菌种在相同发酵时间下产酶活性比A 菌种高，结果见图3。

图3 发酵时间对纳豆激酶活性的影响

3.4 响应面曲面法优化发酵条件

通过单因素实验，可以清楚地看到在相同条件下，B 菌种的产酶活性高于A 菌种，选取B 菌种进行后续优化实验。根据Box-Behnken 的中心组合设计原理，设计了三因素三水平共17 个实验点的响应面分析实验，响应面实验结果见表2。表2 中的数据经Design-Expert 统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表3。经方差分析，方程一次项A 和C，以及二次项影响都是显著的，失拟项不显著（P>0.05），说明方程拟合较好，模型稳定。

表3 响应面实验的方差分析结果

利用软件Design Expert8.0 对实验结果进行分析得到多元二次回归方程：Y1=1366.40-24A+143B-15.00C+12.00AC-10BC-182.2A2-100.2B2-140.2C2。式中Y1为纳豆芽孢杆菌酶活性，A、B 和C 为上述3个变量的编码值。回归系数R2=0.9875 说明回归拟合程度较好。P＜0.0001，说明此方程极显著，模型中的B、A2、B2、C2达到极显著水平，A 达到显著水平，C、AB、AC、BC 影响不显著。由F 值可知，影响纳豆激酶酶活的主要因素依次为B＞A＞C，即接种量＞粉碎方式＞发酵时间。

利用Design Expert8.0 软件可以得到3 个因子之间的响应面分析图和相应的等高图。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。

从表3 方差分析结果可看出，模型的F=61.65403，P＜0.01，表明实验所采用二次模型是高度显著的，在统计学上是有意义的。失拟项用来表示所用模型与实验拟合程度，即二者差异的程度。本实验失拟项P=0.1316＞0.05，对模型有利，无失拟因素存在。同时线性项不显著，平方项极显著，交互作用项显著，表明曲线弯曲度较高，该模型已在最优区域进行拟合。表明该二次回归模型能拟合粉碎方式、接种量和发酵时间对纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶影响。

图4a 显示接种量与粉碎方式的交互作用，随着粉碎程度的增加，产生的酶活力逐渐下降，所以为了简化纳豆杆菌的固体发酵工艺，选择粉碎方式应该为整粒时，纳豆杆菌的酶活性最高；图4b 显示发酵时间与粉碎度的交互作用，随着发酵时间和粉碎程度的升高，酶活性也逐步提高，发酵时间和粉碎程度似乎存在着协同效应；图4c 显示的是接种量与发酵时间的交互作用，随着纳豆杆菌接种量的增加，酶活力越高，但接种量达到9%时，随着接种量的增加，酶活力不再增加，当发酵时间在48 h 左右时，酶活力提高，从经济方面认为，发酵48 h，这个时间段是最佳效益时间。

图4 各因素交互作用对纳豆激酶活性影响的响应面图

对回归方差进行岭迹分析，可得到响应面最佳条件为，A=1/2-0.307×1/8，B=9%+0.9885×2%，C=48-0.2322×12，在最佳条件基础之上将优化条件调整为：颗粒度A=1/2，接种量B=11%，发酵时间C=45 h，对优化条件做验证实验，在该条件下所测得纳豆激酶活性为1 408 U/g，与发酵时间为48 h 时纳豆激酶活性相同，从优化的角度选择45 h。而理论预测值为1 399 U/g，预测值较实测值低9 U/g，两者之间相差较小，说明预测值与实验值之间良好的拟合性证实了模型的有效性。

4 结论

在单因素实验的基础上，应用响应面分析法进行纳豆芽孢杆菌固态培养基优化，结合理论模型和实验得到发酵培养基最佳组成为：粉碎方式1/2 粒、接种量11%和发酵时间45 h 时，在121 ℃下灭菌30 min，经培养优化后纳豆激酶酶活性最高为1 408 U/g 较未优化之前提高了688 U/g。