盐爪爪根际产ACC脱氨酶菌株筛选及促生特性研究

李明源 王继莲 田世梅

（喀什大学生命与地理科学学院/新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆 喀什 844000）

土壤盐碱化是典型的非生物胁迫之一，严重影响植物养分运转和分布，使植物的生殖生理过程受到抑制［1］。我国盐碱土地面积大、分布广，大多植物无法生长导致植被稀少，土地资源浪费的同时还伴随严重的生态问题。研究发现，采用生物接种法，即接种对植物有益的菌群，能有效缓解盐碱胁迫对植物的不利影响［2］，对帮助其在盐碱土中生长及土壤性质改良有积极作用［3］。目前，开发优良微生物菌剂已成为提高非盐生植物耐盐碱性的一种有效策略［4］。

植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是一类广泛存在于植物根际的有益菌，与宿主植物根系代谢活动联系密切。它们不仅能通过直接的营养调控促进植物生长［5］，而且能通过复杂的根际互作网络，表现出对有害致病菌的拮抗作用，增强宿主植物抵抗生物和非生物胁迫的能力［6］。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是植物内源激素乙烯合成的直接前体，当植物遭受逆境胁迫时会发生应激反应，产生大量ACC，导致高浓度乙烯的积累，进而抑制植物生长。而ACC 脱氨酶可以将ACC分解为丁酮酸和氨，减少乙烯的富集［7］。国内外学者已相继从不同盐生植物根际分离到产ACC 脱氨酶菌株，将该菌株作为促生菌剂接种到植物根际，能够提高植物在盐碱胁迫下的生长发育［8-9］。可见，开发具有ACC脱氨酶活性的PGPR菌株作为新型生物肥料菌种来源，对提升植物抗逆性、修复退化生态和促进盐碱地改良有重要意义。

新疆常年气候干旱，是我国盐碱土地面积最大、种类最多，治理最困难的地区，尤其南疆地区土壤盐碱化趋势最严重，制约着区域农牧业的可持续发展。盐爪爪（Kalidiumfoliatum）是藜科盐爪爪属的一类盐生、旱生多汁小灌木，对盐分适应性极强，贮水组织发达，多年来一直是我国西北荒漠地区的建群物种。研究证实，盐爪爪根际蕴藏着丰富多样的微生物类群，具有较强的盐碱耐受性，很多菌株还具有解磷、固氮、分泌吲哚-3- 乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）等促生特性［10-12］。综上，开展盐爪爪根际促生菌资源挖掘，对研制耐盐碱促生菌肥及盐碱土壤改良有重要意义。因此，本研究拟从荒漠盐碱地盐爪爪根际筛选产ACC 脱氨酶菌株，通过盆栽接种试验验证其对盐碱胁迫下植物生长的影响，以期为丰富产ACC 脱氨酶菌种资源及开发适用于盐碱地改良的微生物菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2022年10月，在新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州盐碱地（39°42′N，76°08′E）进行样品采集。区域内植被主要以盐爪爪（Kalidiumfoliatum）、盐节木（Halocnemum strobilaceum）、旱生芦苇（Phragmitescommunis）、盐穗木（Halostachyscaspica）等耐盐碱植物为主，交错连片集中分布。采用多点混合采样法挖取盐爪爪整株根系，轻轻抖落与根系结合较松散的土壤，再用毛刷小心收集与根系紧密结合的根际土，装于无菌器皿并在低温下运回实验室。

盆栽供试土壤采集自喀什市郊未开垦的盐碱地。土壤pH值8.41，全盐含量1.61 g·kg-1，碱解氮、速效钾和有效磷含量分别为24.52、109.14 和16.05 mg·kg-1，有机质含量为15.10 g·kg-1。

1.2 培养基

DF和ADF培养基用于产ACC脱氨酶菌株筛选［13］；蒙金娜有机磷培养基［14］和无氮（nitrogen free medium，NFM）培养基［15］用于菌株解有机磷能力和固氮酶活性测定；King’s B培养基［16］用于菌株产IAA能力测定。菌种保藏与活化采用Luria-Bertani（LB）培养基。为利于耐盐碱菌种筛选，所有培养基的pH值均调至8.0～8.5。

1.3 产ACC脱氨酶菌株的筛选及酶活力测定

称取根际土壤5 g，置于装有45 mL 无菌生理盐水的三角瓶中，放入玻璃珠振荡60 min，得到土壤悬液。将悬液梯度稀释后，均匀涂布至LB 平板，每个稀释度重复3次。25 ℃倒置培养3～5 d，挑取单菌落划线纯化直至获得纯培养菌株。将菌株接种至LB液体培养基，25 ℃、180 r·min-1振荡培养24 h。分别吸取300 μL 菌悬液接种至装有3 mL DF 和ADF 培养基的试管中，25 ℃、180 r·min-1培养72 h，采用比浊法测定培养液吸光值OD600。在连续5次的培养过程中，若菌株在ADF培养基中的生长情况始终优于DF培养基，则认为其能以ACC 为唯一氮源进行生长繁殖，即可产生ACC 脱氨酶。阳性菌株制备成甘油冷冻管于-80 ℃保存。

以2，4-二硝基苯肼为染料，产物α-丁酮酸为检测指标，测定阳性菌株的ACC 脱氨酶活力［13］。用Bradford法测定菌体蛋白量［17］，试验重复3次。以单位蛋白质量的菌体在单位时间内产生α-丁酮酸的量衡量ACC 脱氨酶活性。以每分钟产生1 μmol 的α-丁酮酸量（μmol）为1 个酶活力单位（U），单位酶活力除以总蛋白含量即为比活力（U·mg-1）。各菌株的酶活性测定，均扣除样品对照中自发产物后计算。

1.4 菌株鉴定

采用DNA提取试剂盒（天根生化，北京）提取ACC脱氨酶阳性菌株基因组，以通用引物27F 和1492R 扩增16S rRNA 基因序列。PCR 反应体系为50 μL：PCR Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，正反引物各1 μL，ddH2O补齐至50 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃保持10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送由杨凌天润奥科生物科技有限公司测序。将测序结果拼接后在EzBioCloud 数据库中比对，利用MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.5 植物接种试验

以哥伦比亚型（Col，Columbia）拟南芥和新冬20小麦为供试植物，分别进行非盐碱和盐碱胁迫下盆栽接种试验。供试菌株为ACC 脱氨酶活性最高的3 株菌。试验处理分别为接种供试菌株培养液、灭活的培养液和无菌LB 液体（CK），每个处理5 次重复。接种前，供试菌株在LB 液体培养基中25 ℃、150 r·min-1培养36～48 h，用无菌水调节菌液至OD600≈1（细胞浓度约1010CFU·mL-1）备用。

1.5.1 拟南芥接种试验 拟南芥种子经5%的NaClO溶液消毒5 min，无菌水漂洗3次。用无菌牙签将种子点入育苗盘基质，覆保鲜膜，待种子发芽长出6 片叶后进行接种处理。将制备好的菌液浇灌至拟南芥根部，使基质中的菌浓度达到107CFU·g-1，每组5个重复。将苗盘置于培养室中，培养条件设置为25 ℃、光照14 h/黑暗10 h。定期定量补水，并随机调整花盆位置以使其受光均匀。每隔7 d接种一次，30 d后收获植株分别测量株高、茎粗、鲜重、干重等指标，验证菌株对非盐碱胁迫下拟南芥生长的影响。

1.5.2 盐碱土栽培小麦接种试验 将供试盐碱土壤与基质营养土按7∶3 混匀装盆，每盆约1 kg。挑选饱满的小麦种子同1.5.1 的方法进行消毒。处理后的种子置于放有湿润滤纸的无菌培养皿中，先经4 ℃春化24 h，再于光照培养箱中催芽育苗。5 d 后挑取长势一致的幼苗移栽到花盆中，同1.5.1 方法进行接种处理。统一管理30 d 后收获测定株高、茎粗、鲜重、干重等指标，采用乙醇浸提法测定叶绿素含量［18］，分析接种产ACC脱氨酶菌株对盐碱土栽培小麦的促生效果。

1.6 其他促生潜能分析

1.6.1 解磷能力测定 产ACC 脱氨酶菌株先经LB液体培养24 h，再以5%接种量转接至50 mL 蒙金娜有机磷培养基中，25 ℃、150 r·min-1培养7 d。培养液经12 000 r·min-1离心10 min，取上清按照1∶20 （V/V）加入0.5 mol·L-1的碳酸氢钠溶液浸提30 min，采用钼锑抗比色法测定OD720吸光值［19］。发酵液的有效磷增量（mg·L-1）通过磷标准曲线计算得到。

1.6.2 固氮能力测定 将产ACC 脱氨酶菌株转接至NFM 培养基，能生长的菌株为有固氮能力。阳性菌株经LB液体25 ℃、150 r·min-1培养3 d，以pH 值7.2～7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）调整菌悬液浓度为106CFU·mL-1。按照微生物固氮酶检测试剂盒（上海信裕生物科技有限公司）说明书测定菌株固氮酶活性。

1.6.3 分泌IAA能力测定 将产ACC脱氨酶菌株接种于King’s B 液体培养基，25 ℃、150 r·min-1培养24 h，培养液经12 000 r·min-1离心10 min 取上清，采用Salkowski比色法测定菌株产IAA能力［19］。

1.7 数据统计分析

采用SPSS19.0 软件进行数据处理和方差分析，Duncan 氏法进行多重比较。图、表数据均为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 产ACC脱氨酶菌株筛选及酶活力

从盐爪爪根际土壤共筛选到26 株产ACC 脱氨酶菌株。结合α-丁酮酸测定法和Bradford 法对ACC 脱氨酶活力进行测定，结果显示ACC 脱氨酶比活力为0.4～5.6 U·mg-1（图1）。以PM24 酶活性最高，其次是PM16和PM14，分别为4.7和3.6 U·mg-1。

图1 产ACC脱氨酶菌株酶活性Fig.1 ACC deaminase activity of the isolates

2.2 菌株鉴定

基于菌落形态观察，PM14 和PM16 呈乳白色，圆形略凸起，湿润黏稠，边缘较整齐。PM24菌落呈黄色，圆形半透明，湿润黏稠。革兰氏染色观察PM14、PM16和PM24 均为短杆状，PM14 为革兰氏阴性，PM16 和PM24呈革兰氏阳性（图2）。

图2 ACC脱氨酶菌株革兰氏染色Fig.2 Gram staining of ACC deaminase strains

基于EzBiocloud数据库比对和系统发育分析（图3），PM14 归属肠杆菌属（Enterobacter），与霍氏肠杆菌（Enterobacterhormaechei）序列的最大相似率为99.65%。PM16 属于赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus），与细长赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillusmacroides）的相似度达到99.31%。PM24 属于假单胞菌属（Pseudomonas），与泽澍假单胞菌（Pseudomonaszeshuii）序列的最大相似度为99.17%。

图3 产ACC脱氨酶菌株系统发育分析Fig.3 Phylogenetic tree of 16S RNA sequence of strain with ACC deaminase activity

2.3 接种产ACC脱氨酶菌株对拟南芥幼苗生长的影响

接种产ACC 脱氨酶菌株培养液和灭活培养液均对拟南芥幼苗生长有积极影响，且菌株培养液的促进作用更大（图4）。接种PM14、PM16和PM24培养液后，株高和地上干重相比CK 分别提高了80.3%～87.4%和24.4%～33.1%，其中PM24 对地上干重促进作用最大，PM14 对株高促进最明显。接种灭活培养液后株高相比CK提高了9.7%～25.0%；地上干重相比CK 略有降低，但均差异不显著。

图4 不同处理对拟南芥幼苗生长的影响Fig.4 Effects of different treatments on growth of Arabidopsis thaliana seedling

接种PM14、PM16 和PM24 培养液后，根长和根干重相比CK 分别增加了22.1%～42.5% 和23.7%～178.4%，尤以接种PM24 后根长最长，PM16 根干重最大。接种灭活培养液后的根长和根干重与CK 相比无显著差异。由图5 可见，接种处理明显影响了拟南芥根系发育，其根毛数量相比CK 更多，且更长。综合来看，接种菌株PM24对拟南芥幼苗促生效果最明显。

图5 不同处理对拟南芥幼苗的促生效果Fig.5 The growth-promoting effects of different treatments on Arabidopsis thaliana seedlings

2.4 接种产ACC 脱氨酶菌株对盐碱土栽培小麦生长的影响

相比CK，接种产ACC脱氨酶菌株培养液对小麦株高、茎粗、鲜重和地上干重都有积极作用（图6和7），分别提高了38.7%～55.5%、16.0%～26.5%、35.1%～54.4%和42.8%～52.9%，尤以PM16作用最大。而接种灭活培养液对株高、茎粗、鲜重和地上干重的提高范围分别为1.6%～5.6%、10.8%～18.6%、5.1%～25.7% 和2.6%～12.8%。除接种灭活的PM14外，所有接种处理均增加了叶绿素含量，增加范围为39.5%～66.2%，以PM16影响最大。

图6 不同处理对小麦幼苗生长的影响Fig.6 Effects of different treatments on wheat seedlings

接种菌株培养液使根干重增加了32.4%～178.8%，以PM14 最大。相比于CK，接种灭活培养液也有促进作用，但PM14 和PM24 差异不显著。总体而言，PM16对盐碱土栽培小麦的促生效果最突出。

2.5 菌株其他促生特性分析

2.5.1 解磷能力 菌株PM16 和PM24 具有溶有机磷能力，培养液中有效磷含量分别为34.7和69.5 mg·L-1，显著高于空白对照5.7 mg·L-1（P＜0.05）。PM14 无溶解有机磷能力。

2.5.2 固氮能力 菌株PM14、PM16 和PM24 均可在NFM 无氮培养基生长，固氮酶活性分别为53.9、70.8和42.4 IU·L-1，显著高于空白对照的2.6 IU·L-1（P＜0.05），说明三株菌均具有固氮能力，其中PM16 固氮酶活性最高。

2.5.3 分泌IAA 能力 Salkowski 法分析表明，菌株PM14、PM16 和PM24 均具有分泌IAA 能力，IAA 分泌量分别为27.96、18.34和20.77 μg·mL-1。

3 讨论

自Honma 等［20］首次从土壤中分离出产ACC 脱氨酶菌株并证实其促生特性以来，各国学者相继从多种生境中筛选到产ACC 脱氨酶菌株，其中以芽孢杆菌、假单胞菌和肠杆菌属居多。本研究分离自盐爪爪根际的3 株ACC 脱氨酶高活性菌株分别归属于肠杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和假单胞菌属，与分离自新疆和硕［11］和宁夏银北盐碱区［8］的盐爪爪根际促生菌明显不同，说明产ACC 脱氨酶PGPR 的分布存在生长环境和植物种类特异性。不同PGPR 的适应能力和作用范围也不同，导致从一个地域的特定宿主根际分离的PGPR 在其他地理环境或宿主上不具备普适性。因此，从不同生境或植物根际分离PGPR 资源仍然是开发高效微生物肥料的基础。

有报道表明，只有当菌株的ACC脱氨酶活性（以单位时间内，单位质量ACC脱氨酶所产生的α-丁酮酸的物质的量计）≥20 nmol·mg-1·h-1时，才能起到促生作用［13］。本研究中PGPR菌株的酶活性为0.4～5.6 U·mg-1，远高于从保护区野生稻［21］、荒漠区柠条［22］和盐碱地花生［23］根际分离的菌株。但姬文秀等［24］和王伟楠等［25］分别从人参内生菌和盐穗木根际筛选的产ACC 脱氨酶菌株酶活性高于本研究，且分类地位与植物促生特性各异。而梁翔宇等［12］从宁夏盐碱地盐生植物根际筛选的耐盐促生菌虽然均为芽孢杆菌属，但解磷、产IAA能力与本研究有显著差异。由此说明产ACC脱氨酶菌株在自然界的分布及其促生功能极具多样性，但不同菌株即便是同属菌株，其促生特性也存在巨大差异。本研究中3 株高活性产ACC 脱氨酶菌株为多功能促生菌，具有进一步开发的潜力。但菌株的具体作用机制尚不明确，接种处理对土壤特性、菌群结构和植物生理响应等问题还需深入探究，以全面揭示其促生机理。

接种菌株PM14、PM16和PM24培养液对非盐碱胁迫下的拟南芥幼苗和盐碱土栽培小麦均有促生作用。但不同菌株对不同宿主植物的响应不同，如前人用肠杆菌E.cloacaePM23 接种玉米，在盐胁迫下株高增加了23%～39%，鲜重提高了40%～51%，深入研究发现PM23 的接种提高了植株抗氧化酶活性和渗透保护剂（游离氨基酸、甜菜碱和脯氨酸）水平，显著降低了盐胁迫下玉米植株氧化应激标志物［26］。而从稻田分离的ACC脱氨酶菌株，显著促进了盐胁迫下水稻幼苗生长，且这种作用与抗氧化酶和胁迫诱导乙烯含量的减少有关［27］。本研究中肠杆菌PM14 能促进盐碱土栽培小麦生长，尤其显著促进了根干重，推测其促生机理也与ACC 脱氨酶减少了植株的乙烯含量有关，直接证据还需进一步从ACC 脱氨酶基因AcdS入手解答。此外，不同菌株ACC脱氨酶活性大小不同，影响其在植物根际定殖的关键因素也可能不同，因此造成菌株促生效果的差异。

有报道表明，PGPR的根际定殖受到多种生物环境因素共同影响，包括宿主植物种类、根系分泌物等［28-29］。而土壤温度、含氧量等非生物因素也会影响PGPR 菌株的竞争能力［30］，以上可能综合影响了菌株的促生效果。土壤盐渍化会导致植物根系形态和生理特征发生改变，阻碍植物对土壤水分和矿质营养的吸收［31］。接种PM14、PM16和PM24增加了小麦根干重并促进了根系侧根发育，推测ACC 脱氨酶菌株可能通过改善根系形态，促使其在盐碱胁迫环境中扩展，吸收充足的水分和营养来保证植物的正常生理需求。前人对盐胁迫燕麦和强抗旱苜蓿根系形态特征的研究也得出了相似结果［32-33］。

目前，有关PGPR 产ACC 脱氨酶研究多集中在生理水平上阐明产ACC 脱氨酶菌株对植物水分关系、养分平衡和相容性溶质合成过程的改善，未来还需从核酸和蛋白水平上综合分析其对植物体内参与这些生理过程相关的基因转录和蛋白表达的影响，从而全面阐释产ACC 脱氨酶菌株应答植物盐碱胁迫的机理。总体来看，菌株PM14、PM16 和PM20 在诱导植物耐盐碱促生方面具有一定应用前景，但鉴于实验室条件和大田环境的巨大差异，后续需考察、跟进这些PGPR 菌株的田间应用效果，以更好地改良低产盐碱土壤。

4 结论

本研究从盐爪爪根际筛选到26 株产ACC 脱氨酶菌株，酶活性为0.4～5.6 U·mg-1，以PM14、PM16 和PM24 能力最强，分别归属于肠杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和假单胞菌属。盆栽试验表明，接种PM14、PM16和PM24 能明显促进非盐碱胁迫下拟南芥幼苗生长，并对盐碱土栽培小麦幼苗有积极作用。3 株菌都有多种促生功能，在开发适用于盐碱地应用的微生物肥料方面有一定潜力。