粳糯稻抗稻瘟病基因检测与品种抗性鉴定

邢运高 刘 艳 李 健 迟 铭 杨 波 李景芳 王宝祥 徐大勇

（江苏省连云港市农业科学院/江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏 连云港 222006）

糯稻（OryzasativaL.var.Glutinosa Matsum）是栽培稻的粘性变种，黄淮海地区以种植粳糯为主。随着杂交水稻的推广，糯稻的种植面积大幅减少，由水稻种植总面积9%逐渐减少至1%～2%［1］。近年来糯稻的种植面积逐步回升，如安徽省怀远县97%的水稻为粳糯［2］。当前生产上推广的糯稻品种对稻瘟病的抗性较差，给水稻安全生产带来隐患［1，3］。稻瘟病是威胁我国水稻安全生产的主要病害之一，研究表明抗性基因在抗病育种中发挥着重要的作用［4-5］，因此明确抗性基因的效应具有重要意义。黄淮稻区抗稻瘟病基因效应研究主要集中在Pita、Pib、Pi54、Pikm等4个基因上，不同的学者研究的结果不尽相同。Pib、Pi54基因组合在黄淮稻区粳稻中占比最高，但是两个基因在本稻区的抗性效果一般［4-7］。邢运高等［8］发现Pita对黄淮稻区早熟品种（品系）的稻瘟病的抗性发挥着重要的作用。陈锋等［9］发现黄淮区粳稻中Pikm与稻瘟病抗性相关性显著，而Pita、Pib、Pi54基因与抗性相关性不显著。

近年来，基于竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）原理开发的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）检测技术已在农作物遗传改良方面得到广泛应用［10-11］。KASP 技术具有高通量、低成本、易操作等特点，适用于大规模基因检测要求［12］，已经广泛应用于小麦［13-15］、西瓜［16］、水稻［17］等作物的基因型鉴定。但现有的抗稻瘟病基因研究集中于常规粳稻中，粳糯稻中的抗病基因分布还鲜有报道。鉴于此，本研究利用来源于江苏、安徽、山东、河南等地区65份粳糯品种（品系），通过检测Piz基因座复等位基因（Pi2、Pi9、Pigm）、Pik基因座复等位基因（Pi1、Pikh、Pik）、位于第9 号染色体上的Pi5以及第12号染色体上的Pita这2个广谱抗病基因，通过分子标记检测，明确上述抗稻瘟病病基因在粳糯稻中的分布，并进行连续2 年的抗性鉴定，旨在明确抗性基因与稻瘟病抗病能力之间的关系，评估当前推广的糯稻品种的推广风险，为糯稻抗病育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与种植方法

本研究共征集了65 份粳糯稻品种（品系），按照审定区域（包含参加试验的品系，下同）划分，含有国审品种5 个、江苏审定品种20 个、安徽审定品种18 个、山东审定品种5个、河南审定品种1个以及连云港市农业科学院糯稻品系16个（电子附表1）。2021—2022年所有品种（品系）分为同等的2 份，分别种植于连云港市农业科学院东辛基地（东经119°16′，北纬34°59′）、赣榆塔山稻瘟病鉴定基地（东经119°6′，北纬34°80′），其中东辛基地用于人工接种鉴定，2 年均为5 月20 日播种、6 月25 日移栽，每个品种（品系）种植4 行，每行10 株。塔山基地用于自然诱发鉴定，两年均为5月25日播种、6 月30 日移栽，每个品种（品系）种植4 行，每行10 株，3 次重复，稻瘟病鉴定圃四周种上稻瘟病诱发品种（苏御糯），田间管理同一般大田管理。

表1 不同审定来源中糯稻稻瘟病抗性基因组合模式及比例Table 1 Combination mode and proportion of blast resistance genes of glutinous rice in different approval channels

1.2 抗性基因分型

利用16 个KASP 功能标记（每个基因检测2 个标记）检测8个抗稻瘟病基因。本研究所用的KASP标记以及65 个糯稻品种（品系）抗病基因检测全部委托华智生物技术有限公司（长沙）完成。

1.3 稻瘟病抗性鉴定

1.3.1 稻瘟病抗性鉴定方法 2021—2022 连续两年通过人工接种鉴定和自然诱发鉴定两种方式鉴定水稻品种（品系）的稻瘟病抗性。稻瘟病人工接种鉴定菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，为江苏省稻瘟病菌优势小种及其各群小种的代表菌株。2021年代表菌株是2021-3、2021-43、2021-71、2021-150、2021-497 共5 个菌株；2022 年代表菌株是2022-113、2022-313、2022-406、2022-417、2022-556、2022-586 共6 个菌株。水稻孕穗至破口期采用混合菌株进行接种，每品种（品系）任选接5 株，每株接种1 个穗子，每穗注射1 mL孢子悬浮液，并用订书机打上颜色标记。在水稻成熟后进行水稻穗颈瘟的抗性调查。自然诱发鉴定种植于连云港市农业科学院塔山稻瘟病鉴定基地。

1.3.2 稻瘟病调查标准 接种鉴定方法以及水稻穗瘟单穗损失率、穗瘟发病率群体抗性分级标准参照《NY/T 2646—2014 水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》［18］执行，定义0 级为高抗（HR）、1 级为抗（R）、3 级为中抗（MR）、5 级为中感（MS）、7 级为感（S）、9 级为高感（HS），本研究中定义0～3 级为抗病，5～9级为感病。

1.4 数据处理

利用Excel 2016 对数据进行处理和作图，利用SPSS 19 经行系统聚类分析。聚类方法采用ward 法，采用欧式距离作为聚类分析的距离测量方法。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病抗性基因分子检测与基因分布

利用16 个KASP 功能标记（每个基因检测2 个标记，相互验证）检测65 份糯稻品种（品系）中Pi2、Pi9、Pigm、Pi1、Pikh、Pik、Pi5和Pita等8个抗稻瘟病基因，结果发现除了Pigm外，其他7个抗病基因在糯稻品种（品系）中都有不同程度的分布，但是占比相差较大（图1）。Pita基因在供试材料中占比最高，达到了67.7%，其次是Pikh、Pi9、Pi2、Pi5，占比为47.7%、38.5%、27.7%和13.8%。仅有苏秀889、香血糯515 以及连227-20 等3个品种（品系）携带Pik基因，占供试品种的4.6%。仅有EB06 携带Pi1，占比1.5%。分析供试的糯稻品种（品系）中携带的基因数量，结果表明供试的糯稻品种（品系）携带0～4 个抗病基因不等，多数品种（品系）携带2～3 个基因，其中携带3 个抗性基因的品种（品系）最多，占比40%（图2）。仅有连糯19105携带4个抗性基因。皖糯6 号、圣糯1 号、华糯669、连糯1 号等4 个品种（品系）没有检测到抗性基因。

图1 8个稻瘟病抗性基因在糯稻中分布Fig.1 Distribution of eight blast resistance genes in glutinous rice

图2 65份检测材料中携带的基因的数量分布Fig.2 Quantitative distribution of genes carried in 65 test materials

从糯稻品种审定地域来看，国家审定的品种携带的抗性基因最多，平均携带2.4 个，其次是江苏审定的品种，平均达到2.1 个，安徽审定的次之，山东的最少（图3）。从具体携带的抗性基因来看，国审以及江苏审定的糯稻品种中携带Pita的品种明显高于安徽以及山东审定的品种。安徽审定的糯稻品种携带Pi9的比例明显高于其他3 个审定区域，而山东审定的糯稻品种携带Pi5的比例明显高于其他3 个审定区域。山东糯稻品种中不携带Pi2基因，Pik基因仅存在于国审以及江苏审定的品种中（图4）。从基因组合方式来看（表1），国审品种有5 种不同基因组合方式，且供试品种均携带Pita基因。来源于江苏的糯稻品种有13 种基因组合方式，基因组合类型最丰富，Pi9+Pikh+Pita和Pi2+Pikh+Pita基因组合的品种（品系）最多，分别占江苏审定品种数的22.2%、19.4%。安徽审定品种基因组合较为丰富，有10 种基因组合方式，其中Pi9+Pikh+Pita基因组合占比最多，占比22.2%，其次是携带单独Pi9基因的品种，占比16.7%。山东审定品种（品系）有4 种基因组合模式，携带单个抗性基因的品种最多，达到80%。

图3 不同审定来源中糯稻稻瘟病抗性基因的个数Fig.3 Number of blast resistance genes of glutinous rice in different approval channels

图4 不同审定来源中糯稻稻瘟病抗性基因的分布Fig.4 Distribution of blast resistance genes of glutinous rice in different approval channels

2.2 糯稻品种（品系）稻瘟病抗性鉴定

为了明确糯稻种的抗性情况，本研究对65 个糯稻品种（品系）进行了连续两年稻瘟病接种鉴定。2021年自然诱发鉴定以及人工接种鉴定苏御糯都达到了7 级以上，2022年东辛人工接种鉴定苏御糯达到了9级，而赣榆基地自然诱发品种苏御糯发病未达7 级且田间整体发病较轻，故2022 年田间自然诱发鉴定结果不作统计。由图5 可知，2021—2022 年稻瘟病鉴定的发病比例差异较大。

图5 不同年际间抗病品种比例Fig.5 Proportion of disease resistant varieties in different years

按照中抗（3 级）及以下定义为抗病标准，2021 年田间自然诱发鉴定结果表明抗病品种（品系）比例为41.5%，糯稻品种（品系）在各个发病级别中分布的较为均匀，其中0 级的材料有10 个，占比15.4%；1、7级的材料各有10 个，各占比13.8%；3、5 级的材料各有8 个，各占比12.3%；9 级的材料有20 个，占比30.8%。

2021 年人工接种鉴定结果表明抗病品种（品系）比例为24.6%，品种（品系）的发病级别集中在3～9 级，其中1 级的材料有1 个，占比1.5%，3、7 级的材料各有15个，各占比23.1%；5级的材料最多，共有23个，占比35.4%；9 级的材料有11 个，占比16.9%。2022 年人工接种鉴定结果表明抗病品种（品系）比例仅为6.2%，品种（品系）的发病级别集中在7～9 级，占比73.8%，没有0、1 级的抗病品种（品系）。连续两年的接种鉴定结果表明，糯稻品种（品系）的抗病水平较差，糯稻的安全生产存在较大隐患（图6）。

图6 3种鉴定方式下不同发病级别糯稻品种所占比例Fig.6 Proportion of glutinous rice varieties with different disease levels under three identification methods

从携带抗性基因来看，因只有来自安徽的品种EB06携带Pi1基因，没有统计意义，故不作说明。携带Pik基因的糯稻品种（品系）连续两年的抗病品种（品系）都达到了66.7%以上，抗病效果较好，可以加强利用。Pita在年际间的抗性表现要好于Pi2、Pi9、Pi5、Pikh，在2022 年接种发病很重的年份，仍有25%的糯稻品种（品系）达到了中抗以上。Pi2、Pi9、Pi5、Pikh虽然在2021 年自然诱发鉴定中表现出较强的抗病性，但年际间稳定性较差，育种利用时应注意与其他抗病基因聚合（图7）。

图7 携带不同抗稻瘟病基因糯稻品种在3种鉴定方式下抗病品种占比Fig.7 Proportion of resistant varieties of waxy rice carrying different blast resistance genes under three identification methods in different approval channels

从审定来源来看，国审、江苏审定、安徽审定的糯稻品种在2021 年田间自然诱发鉴定中抗病的品种数差异不大，而在2021—2022 两年接种鉴定结果中国审糯稻品种的抗性优于省审品种，山东审定的糯稻品种抗性较差，没有中抗及以上的糯稻品种（图8）。

图8 不同审定来源中糯稻抗稻瘟病品种比例Fig.8 Proportion of glutinous rice varieties resistant to rice blast in different approval channels in different approval channels

2.3 抗性基因与抗病能力间相关性分析

供试品种（品系）共20 种基因组合方式（表2），33.3%的供试品种只含1 个或不携带任何抗性基因。连续两年抗性鉴定结果表明，不携带任何抗性基因的品种（品系），感病比例为100%且病级均为7～9 级，抗性差。只携带1 个抗性基因的供试品种（品系），在连续两年的人工接种鉴定中，除了携带Pita基因品种（品系）在2021年有28.6%的抗病比例，其他均为感病，说明携带单个抗性基因的品种（品系）抗性效果较差。携带2 个抗性基因Pi2+Pi5、Pi2+Pi1、Pi2+Pik、Pi9+Pita的供试品种（品系）在2021 年自然诱发鉴定表现较好，抗病品种（品系）比例达到100%，但是两年的接种表现较差。携带3 个抗性基因的供试品种（品系）抗性表现明显好于携带0～2 个抗性基因的品种（品系），其中Pi2+Pita+Pik、Pi9+Pita+Pik连续两年的自然诱发鉴定和人工接种鉴定抗病品种（品系）的比例均达到100%，年际间抗病稳定。同时，本研究发现携带Pi2+Pik基因组合的供试品种（品系），连续两年人工接种结果都是感病，当加入Pita基因时，抗病效果明显提升。以上结果说明Piz基因座（Pi2、Pi9）+Pita+Pik基因组合在糯稻抗稻瘟病育种中具有重要的利用价值。本研究中只有1 个品种（品系）连粳19105 携带4 个抗性基因，基因型是Pi2+Pi5+Pikh+Pita，该品种（品系）在年际间表现不稳定，说明抗病性不随携带的抗性基因增多而变强。

表2 不同基因组合方式抗病品种（品系）比例Table 2 Ratio of resistant varieties with different gene combinations/%

2.4 抗性基因的聚类分析

根据聚类分析结果，将65 个品种（品系）分为4 个大类（图9）。第Ⅰ类包含连糯19105、连209-3、圣香糯1 号、盐糯13138、扬粳糯6 号、D12、连209-5、武香糯2323、小扇糯、Z1、连209-10、连209-13、连209-16、连209-21、华浙糯1 号共15 个品种（品系），该类品种（品系）包含国家审定、江苏审定、安徽审定、山东审定等4个地域的品种（品系），分布较广；第Ⅱ类包括连227-20、连209-17、连209-18、连209-8、连209-12、连209-1、连209-4、连209-9、连209-15、连209-20、中种香糯、兆糯168、连糯18516、皖垦糯5 号、抚晚糯、EB06、苏秀糯889 等共17 个品种（品系），该类品种（品系）均携带Pi2基因，且大部分为连云港市农科院育成的糯稻品种（品系），占该类品种（品系）的比例为70.6%，说明对Pi2基因的利用明显多于其他地区；第Ⅲ类包括春糯22、LH1948、金粳糯6288、宁香糯1 号、扬农糯481、武香糯7368、武香糯109、武香糯18196、武香糯9106、豪粳糯、信粳糯631、粳糯2402、富糯628等13个品种（品系），该类全为江苏、安徽两省的审定的品种或有关联的品种（品系），其中信粳糯631的母本为皖稻68，说明这两省的粳糯品种（品系）有部分相似性；第Ⅳ类包括扬产糯2号、丰糯99、中粳糯588、丰糯1246、圣武糯0146、皖垦糯1号、金丰糯2号、合肥糯、中研糯135、香血糯515、紫香糯2315、圣稻139、皖垦糯3号、凯糯398、苏御糯、大华香糯、华糯669、连糯1号、皖糯6号、圣糯1号等20个品种（品系），该类品种（品系）数最多，以抗性较差的品种（品系）为主。

3 讨论

稻瘟病是世界所有水稻产区的主要病害之一，抗病基因的挖掘以及抗性效应的鉴定是水稻抗病育种利用的基础［19］。本研究对65 份粳糯稻品种（品系）进行连续两年进行穂颈瘟抗性自然诱发鉴定以及人工接种鉴定，同时利用KASP标记对8个抗稻瘟病基因分子检测。结果显示，2021 年自然诱发鉴定、2021 年人工接种鉴定以及2022 年人工接种鉴定中抗以上品种（品系）的比例分别是41.6%、24.6%和6.2%，说明粳糯稻品种（品系）的稻瘟病抗性年际间波动大、整体抗病性一般，生产上有较大风险。两年自然诱发鉴定都比人工接种鉴定的发病轻，特别是2022 年自然诱发的对照品种苏御糯的穗颈瘟抗性未达7级，整个鉴定圃的发病较轻，而当年人工接种鉴定近94%的品种（品系）为感病品种（品系），推测是由于自然诱发鉴定受到温度、湿度、生理小种变异、稻田带菌量等因素的影响，而人工接种鉴定给每个稻苞中注入相同体积的菌液（1 mL），发病环境相对稳定，更利于稻瘟病的发生。

从具体携带的抗性基因来看，Pita基因在供试材料中分布频率最高，达到了67.7%，且年际间的抗性较为稳定。国审以及江苏审定的糯稻品种中携带该基因的品种明显高于安徽以及山东审定的品种，Pita携带比例为100%、77.8%，明显高于前期研究中对黄淮稻区常规粳稻携带该基因的结果［7-8，20］，可能是由于本研究征集的糯稻品种（品系）多数是近5 年审定或参试的品种（品系），而近年来育种家注重了对Pita基因的利用。携带Pi9的品种（品系）占比38.5%，而安徽审定的糯稻品种（品系）携带Pi9的比例明显高于其他3 个审定区域，占该省供试品种（品系）的60%以上，可能与该省是籼稻主产区之一，而Pi9在籼稻中分布较广有关。陈晴晴等［21］分析2018—2010 年长江中下游籼稻区试水稻品种（品系）携带抗稻瘟病基因分布情况，发现携带Pi9的品种（品系）在三年区试中占比分别为65%、54.3%以及76.1%。山东审定的糯稻品种（品系）携带Pi5的比例明显高于其他3 个审定区域，占该省供试品种（品系）60%以上。张善磊等［22］、闫影等［23］研究表明Pi5对穗颈瘟的抗性效果较好，该基因可能为山东地区的优势抗性基因。以上结果表明，不同地区糯稻品种（品系）携带抗性基因差异较大，互相引种备案时要注重对稻瘟病抗性的评测。

前人研究表明，携带单一抗性的品种（品系）在种植若干年后抗性会逐步丧失［24-25］。本研究中，糯稻品种（品系）携带0～4 个抗病基因不等，其中不携带任何抗病基因的品种（品系）抗性最差，连续两年的人工接种皆为7～9 级。从品种的审定时间来看，同一审定区域早期审定的品种携带抗性基因的数量较少，如2014 年江苏审定的连糯1 号、2018 年山东审定的圣糯1 号均不携带任何抗稻瘟病基因，而本研究收集的连糯系列糯稻新品系以及国审（近3 年审定）品种均携带抗稻瘟病基因，平均达到2个以上，即新育成品种（品系）携带的稻瘟病基因较多。携带3 个抗性基因的供试品种（品系）抗性表现明显好于携带0～2个抗性基因的品种（品系）。如携带Pi2+Pik基因组合的供试品种（品系），连续两年人工接种结果都是感病；当加入Pita基因时，即Pi2+Pita+Pik基因组合连续两年的自然诱发鉴定和人工接种鉴定抗病品种（品系）的比例均达到100%，年际间抗病稳定。此外，香血糯515 携带的抗性基因组合是Pi9+Pita+Pik，该品种连续两年抗性鉴定皆为中抗及以上。以上结果说明，Pita+Pik基因组合加上Piz基因座上两个复等位基因（Pi2、Pi9），抗稻瘟病水平能够得到明显提升。本研究只有1 个品种（品系）携带4 个抗病基因，基因型为Pi2+Pi5+Pikh+Pita，该品种只有2021 年人工接种表现为中抗（3 级），2021 自然诱发鉴定以及2022 人工接种鉴定均为中感（5 级），说明携带基因的数目与抗病性之间没有密切关联性，这与周坤能等［26］、邓钊等［27］和王军等［28］的研究结果一致。

4 结论

本研究通过分析65 个糯稻品种（品系）的稻瘟病抗性，以及抗性基因的分布情况，发现糯稻品种（品系）的稻瘟病抗性较差，不同审定来源的品种（品系）携带的抗性基因差异较大。“Pi2+Pita+Pik”、“Pi9+Pita+Pik”年际间抗病稳定，可作为改良粳糯稻瘟病抗性主要的基因组合。