GQDs/WS2/Fe3O4 磁分离适配体荧光传感器构建及其在甲胎蛋白中的应用

李肖沙，刘莹，申炳俊，金丽虹，夏冰

（1.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022；2.杭州隆基生物技术有限公司，杭州 311121）

甲胎蛋白（Alpha-Fetal Protein，AFP）是白蛋白家族中一种糖蛋白，其分子量约为67～70 kDa。1956 年，Bergstrand 等人［1］首先在胎儿的脐带血清中发现了AFP，之后Abelev 等人［2］证实了AFP 主要来源于胚胎卵黄囊和胎盘。1968 年，Tatarinov［3］在肝癌患者血清中检测到了大量AFP。自此以后，AFP 作为一种重要的血清肿瘤标志物，被广泛应用于原发性肝癌、睾丸、卵巢肿瘤早期诊断以及胎儿先天畸形排查等临床检测领域［4］。由于成人血清AFP 含量极低，如何低检测限、宽线性范围进行血清AFP 定量检测，具有重要的临床意义。

AFP 从发现至今已经发展了多种检测方法，如放射免疫分析法［5］、荧光免疫分析法［6］、酶联免疫吸附法［7］、化学发光免疫分析法［8］、电化学免疫传感器［9］和电化学适配体传感器等［10］。适配体（Aptamer，Apt）是一种人工筛选出来的单链DNA 或RNA 分子［11-12］，它能够高特异性和高亲和力与靶标结合，过程类似抗原-抗体的结合反应。然而，适配体本身不具有信号指示作用，以适配体分子为识别元件的传感器需要结合可识别信息，如电、光、热、质或声等［13-14］。荧光适配体传感器兼具荧光检测的高灵敏性和适配体传感器的高选择性，还具有精度高、检测速度快、操作简单和成本低等优点，是近年来生物传感器的重点发展方向之一［15-16］。

本文以聚乙二醇化石墨烯量子点标记的适配体（GQDs-PEG-Apt）作为信标探针，利用载有四氧化三铁纳米颗粒的二硫化钨纳米片（WS2/Fe3O4）对单链适配体的吸附作用、荧光猝灭能力以及磁分离性质，构建一种GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感器并用于AFP 定量检测，原理如图1 所示。从聚乙二醇钝化石墨烯提高其荧光性能、磁分离WS2/Fe3O4纳米复合物吸附GQDs-PEG-Apt 降低荧光背景值两方面，来提高传感器检测AFP 线性范围及检测限。根据AFP 含量对体系中能量供体与受体间非辐射共振能力转移（Forster Resonance Energy Transfer，FRET）效应引起荧光信号恢复信息，建立一种宽线性范围、低检测限的AFP 定量检测方法。

图1 GQDs/WS2/Fe3O4 磁分离适配体荧光传感器检测AFP 原理

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

沥青基碳纤维购自日本东丽；二硫化钨粉末、乙酰丙酮铁购自美国Sigma 公司；聚乙二醇（NH2-PEG-NH2）购自于芃硕生物科技公司；1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）均购自美国Sigma 公司；meso-2，3-二巯基琥珀酸（DMSA）购自上海阿拉丁；其他试剂均购自北京化工；甲胎蛋白（AFP）、糖蛋白19-9（CA19-9）、糖蛋白242（CA242）和人血清白蛋白（HSA）均购自于上海领潮生物科技公司；适配体（Apt，5ʹ-COOH-TAG ATATGGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGG AAGGTGTTTAAATTCCCGGGTCTGCGTGGTCTGTG GTGCTGT-3ʹ）购自上海生工。

1.2 实验方法

1.2.1 GQDs-PEG-Apt 制备及表征

首先，制备羧基化GQDs（GQDs-COOH），采用自上而下法制备GQDs，柠檬酸孵育使GQDs 表面引入羧基，得到GQDs-COOH，调节溶液pH 值，透析袋透析，浓缩后冷冻干燥。其次，制备PEG功能化GQDs（GQDs-PEG），EDC/NHS 法进行PEG功能化GQDs，微孔膜过滤大团聚体，得到小粒径GQDs-PEG。最后，制备PEG 功能化GQDs 标记的适配体（GQDs-PEG-Apt），EDC/NHS 法使适配体5'端羧基与GQDs-PEG 氨基进行偶联，产物GQDs-PEG-Apt 溶液采用超滤离心管进行纯化和浓缩。实验过程需要避免GQDs 发生光漂白。

1.2.2 WS2/Fe3O4纳米复合物制备及表征

首先，采用水热合成法制备WS2纳米片，得到的固体用超纯水充分洗涤，分散在乙醇中固体，超声、离心，上清液为WS2纳米片溶液。然后，溶剂热合成法制备Fe3O4纳米颗粒，与DMSA孵育，获得DMSA 修饰的Fe3O4纳米颗粒。最后，制备WS2/Fe3O4纳米复合物，DMSA 修饰WS2纳米片和Fe3O4纳米颗粒孵育，获得WS2/Fe3O4纳米复合物。

1.2.3 GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感器荧光猝灭条件优化

一定量WS2/Fe3O4纳米复合物溶液和200 μL的GQDs-PEG-Apt 溶液孵育，摸索孵育温度、时间、pH 值和WS2/Fe3O4纳米复合物投入量对GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感器性能影响。荧光测量条件为：荧光发射谱波长（λem）范围为400～600 nm，激发波长（λex）固定为359 nm，激发/发射狭缝为10 nm/5 nm。

1.2.4 AFP 检测条件优化

GQDs-PEG-Apt 与WS2/Fe3O4纳米复合物构成的GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感体系，黑暗条件下分别与0、2、10、50、100、300、500、800、1 000 和1 500 ng/mL 的AFP 抗体靶蛋白进行孵育，摸索孵育温度、时间、pH 值和靶蛋白投入量对pH 检测影响。荧光测量条件同1.2.3 节。

1.2.5 血清AFP 检测

肿瘤标志物AFP、CA19-9 和CA242 加入到人血清中，利用GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感体系进行血清AFP 检测，研究传感器特异性、灵敏度和准确性等性能。

2 实验结果与分析

2.1 功能化GQDs 制备及表征

由图2（a）可见，羧基化GQDs（GQDs-COOH）呈现近圆形，分散性良好，平均粒径约5 nm，GQDs 的晶格结构清晰可见，晶格间距0.21 nm，与文献［17］报道GQDs 的（002）晶面间距相吻合。PEG 功能化GQDs（GQDs-PEG）在乙醇中呈现类方形聚集体，如图2（b）所示，平均粒径8 nm，较GQDs-COOH 粒径有所增加，这应与GQDs 表面羧基与PEG 氨基发生键合作用有关。

图2 羧基化和聚乙二醇化石墨烯量子点的TEM和HRTEM

GQDs 进行PEG 功能化前后最大激发和最大发射光谱如图3 所示。GQDs-COOH 荧光激发（λex）和发射波长（λem）分别为468 nm 和504 nm，斯托克斯位移为36 nm。PEG 功能化后GQDs 荧光强度显著增高，359 nm 激发时，GQDs-PEG 在444 nm 和485 nm 两波长处出现明显的荧光发射峰，485 nm 荧光峰强度略高于444 nm，斯托克斯位移为126 nm，λex和λem分别蓝移109 nm 和60 nm。在可见光照射下，GQDs-COOH 呈现棕黄色、GQDs-PEG 则呈现淡黄色。365 nm 紫外光照射下，GQDs-COOH 发出蓝绿色荧光，GQDs-PEG 则发出强蓝色荧光。此外，放置时间对PEG 功能化前后GQDs 荧光强度影响有所差别，GQDs-COOH 溶液荧光强度随着放置时间增加而逐渐降低，放置时间为20 天时，荧光强度降低43.2%，表明羧基化GQDs 在溶液中并不稳定。而PEG 功能化GQDs，放置时间对其溶液荧光强度影响较小，即使放置30 天，GQDs-PEG 荧光强度变化不明显，说明PEG 功能化有利于提高了GQDs 荧光稳定性。

图3 石墨烯量子点PEG 化前后荧光光谱

2.2 WS2/Fe3O4 纳米复合物制备及表征

WS2/Fe3O4纳米复合物透射电镜（TEM和HRTEM）如图4 所示，其平均直径在220±35 nm，WS2纳米片则呈现不规则片状形态。HRTEM 清晰地呈现0.62 nm 和0.253 nm 两种晶格间距，分别对应WS2的（002）和Fe3O4的（311）晶面结构［18］。

图4 WS2/Fe3O4 纳米复合物TEM（标尺20 nm）和HRTEM（标尺5 nm）

2.3 GQDs/WS2/Fe3O4 磁分离适配体荧光传感器可行性分析

WS2/Fe3O4纳米复合物吸收光谱如图5 蓝色曲线，在370～680 nm 范围内该复合物存在吸收带，吸收峰出现在648 nm。GQDs-PEG-Apt 荧光光谱（图5 红色曲线）与WS2/Fe3O4纳米复合物吸收光谱有重叠，这是产生FRET 的前提条件。WS2/Fe3O4（100 μL，600 μg/mL）纳米复合物加入到GQDs-PEG-Apt 体系后，其荧光强度被猝灭高达69.8%，如图6 所示。因此，以适配体为AFP 分子识别元件、GQDs-PEG-Apt 为荧光探针构建GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感器是可行的。

图5 WS2/Fe3O4吸收光谱和GQDs-PEG-Apt荧光光谱重叠

图6 WS2/Fe3O4 对GQDs-PEG-Apt 荧光光谱影响

2.4 GQDs/WS2/Fe3O4 磁分离适配体荧光传感器及AFP 检测条件优化

建立具有高荧光猝灭效率的FRET 检测体系，对FRET 能量供体GQDs-PEG-Apt 与荧光猝灭剂WS2/Fe3O4纳米复合物能量受体孵育条件进行了优化。WS2/Fe3O4纳米复合物对GQDs-PEGApt 在487 nm 处荧光强度（IF）和荧光猝灭效率（QE=（I0-I）/I0，I0和I分别为WS2/Fe3O4加入前、后GQDs-PEG-Apt 荧光强度）影响如图7 所示。可以看出，WS2/Fe3O4浓度在0～420 μg/mL 时，GQDs-PEG-Apt 在487 nm 处荧光强度随WS2/Fe3O4浓度增加呈现先降低后增加趋势，对荧光猝灭效率影响则相反。WS2/Fe3O4浓度为300 μg/mL 时，GQDs-PEG-Apt 在487 nm 处荧光强度和荧光猝灭率分别达到了最小值和最大值。GQDs-PEG-Apt荧光被猝灭原因在于，GQDs-PEG-Apt 与WS2/Fe3O4间π-π 堆积作用和FRET。

图7 WS2/Fe3O4 对GQDs-PEG-Apt荧光强度和荧光猝灭率影响

孵育温度、体系pH 值和孵育时间对GQDs/WS2/Fe3O4体系487 nm 处荧光强度和荧光猝灭率影响结果如图8 所示。可以看出，孵育温度为37 ℃时，GQDs/WS2/Fe3O4体系487 nm 荧光强度最低，37 ℃是构建传感器GQDs-PEG-Apt 与WS2/Fe3O4最佳孵育温度。pH 值在6.0～8.6 范围内，各GQDs/WS2/Fe3O4体系间荧光猝灭率间差异不大，但pH值会改变适配体空间结构，进而影响GQDs-PEG-Apt 与靶受体AFP 间特异性结合和结合常数。此外，AFP 的检测样本为血清，为此采用生理环境7.4 为传感器体系构建pH 值。孵育时间在25 min 时，WS2/Fe3O4对GQDs-PEG-Apt 在487 nm荧光猝灭程度最大，25 min 为两者间的最佳孵育时间。

图8 孵育温度、体系pH 值和孵育温度对GQDs/WS2/Fe3O4 荧光强度和荧光猝灭率影响

GQDs/WS2/Fe3O4体系构建条件为：WS2/Fe3O4投入量300 μg/mL，GQDs-PEG-Apt 与WS2/Fe3O4间孵育温度、pH 值和孵育时间分别为37 ℃、7.4 和45 min。

2.5 AFP 检测线性范围、灵敏度及特异性

GQDs/WS2/Fe3O4体系在487 nm 处荧光强度随AFP 浓度增加而增大，以AFP 浓度（CAFP）为横坐标、荧光相对恢复值（ΔIF=I1-I2，I1和I2是加入AFP 前后的荧光强度）为纵坐标进行线性拟合，其结果如图9 所示。可以看出，浓度在5～1 000 ng/mL 范围内，CAFP和ΔIF具有良好的线性相关性，其线性方程为y= 4.000 036x+363.771 46（R2=0.977 53）。根据这一结果，可获得3 倍SD（3SD）下，GQDs/WS2/Fe3O4荧光适体传感器检测AFP 的最低检测限（LOD）为0.5 pg/mL。

图9 AFP 浓度与体系487 nm 处荧光恢复值线性关系

AFP、PSA 和HSA 浓度为1 000 ng/mL、CA19-9和CA242 浓度为1 000 U/mL。分别以AFP、CA242、CA19-9、PSA 和HSA 为靶标，考察不同检测物对磁分离适配体荧光传感体系荧光恢复率（增强）的影响，结果如图10 所示。可以看出，文中构建的传感体系中加入AFP 后，可显著提高荧光强度，而CA242、PSA 和HSA 对体系荧光增强效果不明显。原因是传感器中的适配体仅能特异性识别AFP，并与之结合。因此，GQDs/WS2/Fe3O4磁分离荧光增强型适配体传感可用于AFP 的特异性检测。

图10 干扰物对GQDs/WS2/Fe3O4 磁分离适配体荧光传感体系荧光恢复率影响

与现有AFP 检测方法相比，文中构建的GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感器对AFP 检测线性范围更宽，达到5～1 000 ng/mL；检测限（LOD）更低，其值为0.5 pg/mL。文献所述方法［19-25］与本文方法的性能比较结果如表1 所示。

表1 用于肿瘤标志物AFP 检测的不同方法的性能比较

2.6 血清AFP 定量检测

磁分离荧光增强型适配体传感检测AFP（10、20 和50 ng/mL）血清样本结果（n=3）、相对标准偏差（RSD）和回收率如表2 所示。实验结果表明，AFP 的RSD 在3.32%～6.41%，回收率为91.92%～99.28%。因此，传感器适用于实际血清样本AFP 的测定。

表2 血清肿瘤标志物AFP 加标真实样品的回收率

3 结论

文中制备了具有蓝色荧光性能GQDs 和磁分离WS2/Fe3O4纳米复合物，基于适配体特异性结合靶标性质和FRET 原理，以GQDs-PEG-Apt 作为AFP 特异性识别分子和能量供体，WS2/Fe3O4纳米复合物为能量受体，构建磁分离适配体荧光传感器并检测血清肿瘤标志物AFP，明确传感器构建和AFP 检测实验条件。结果显示，GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感器定量检测AFP 线性范围为5～1 000 ng/mL，检测限为0.5 pg/mL。构建的传感器实现了血清中AFP 定量检测，其具有特异性好、灵敏度高、检测范围宽、低检测限和操作简单等优势。更重要的是，文中建立的GQDs/WS2/Fe3O4磁分离适配体荧光传感体系还为其他糖蛋白生物标记物等定量检测提供了技术理论和实验基础，在临床血液肿瘤标志物检测领域具有较高的应用价值和市场发展空间。