血清中TLR4、NF-κB 对儿童难治性肺炎支原体肺炎的早期预测价值

王永芳，许玉芳，程艳波，李琳楠，曾培培，李伟霞，张成云

（郑州市第一人民医院，1.儿科，3.检验科，河南 郑州 450004；2.河南省人民医院儿科，河南 郑州 450003）

近年来，难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）发病率有上升趋势，其病情进展快，重者可合并闭塞性细支气管炎、坏死性肺炎等，并造成不同程度的肺外系统的损害，严重威胁患儿生命[1-2]。对RMPP 及早发现并尽早规范治疗，有利于避免或减轻并发症，改善RMPP 的预后。目前认为，RMPP 的发病过程与免疫因素密切相关[3-4]。研究显示TLR4/NF-κB信号转导通路参与RMPP 的发生、发展[5-7]。本研究探讨血清中TLR4、NF-κB 对RMPP 的预测价值，为临床早期诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年6月—2022年7月郑州市第一人民医院儿科、河南省人民医院儿科二病区收治的确诊为MPP 的患儿69 例。其中普通MPP（MPP 组）36例，男19 例，女17 例，年龄（5.51±3.12）岁；RMPP（RMPP 组）33 例，男21 例，女12 例，年龄（5.74±3.14）岁。两组性别、年龄、入院时病程及入院前治疗情况等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究病例监护人均知情同意并签署同意书，并通过郑州市第一人民医院伦理委员会审核批准，批准号：2019-018。

1.2 纳入、排除标准

1.2.1 纳入标准 所有病例入院时病程均在7 d 内。符合MPP、RMPP 诊断标准[3]。MPP 的诊断标准：有发热、咳嗽等肺炎表现及影像学肺炎改变，单次检测血清Mp-IgM 滴度≥1∶160。RMPP 的诊断标准：在确诊MPP的前提下，经大环内酯类抗菌药物正规治疗7 d 及以上，仍持续发热，临床征象及肺部影像学加重者。

1.2.2 排除标准 合并其他病原体感染者，合并其他呼吸系统疾病和/或其他系统原发疾病者，免疫功能低下者等。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及保存 入院后12 h 内采外周静脉血3 mL。标本血均在3 h 内于3 000 r/min 离心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存待检测。

1.3.2 标本检测 采用酶联免疫吸附法[试剂盒购自上海酶联生物有限公司，批号：E20220217-10223A（TLR4）；E20220217-15430A（NF-κB）]检测血清TLR4、NF-κB 水平，具体操作严格按说明书进行。主要步骤如下：将标准品稀释后加样，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5 倍）。每孔加入酶标试剂100 μL。封板置37 ℃温育60 min。弃液，甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置30 s 后弃去，重复5 次，拍干。加入显色剂A、B各50 μL，混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液终止反应。450 nm波长依序测量各孔的吸光度；经过标准曲线换算计算出浓度值。

1.4 统计学处理

应用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析。正态分布计量资料用（）表示，并进行方差齐性检验，两组间比较使用t检验。计数资料采用卡方检验。采用相关分析法分析相关指标的相关性。采用ROC 曲线及AUC（95%CI）评估检测指标的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿一般资料比较

RMPP 组与MPP 组两组患儿性别、年龄、入院时病程、入院前治疗情况（仅抗病毒治疗，仅抗细菌治疗，抗病毒+抗细菌治疗，应用大环内酯类药物等）比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组患儿一般资料比较(±s)Table 1 Comparison of general data between the two groups

表1 两组患儿一般资料比较(±s)Table 1 Comparison of general data between the two groups

组别RMPP组MPP组t/χ2值P值性别（男/女，例）21/12 19/17 0.465＞0.05年龄/岁5.74±3.14 5.51±3.12-0.302＞0.05入院时病程/d 4.88±0.992 4.47±0.972 1.720＞0.05

2.2 两组患儿血清中TLR4、NF-κB水平比较

比较两组患儿血清中TLR4、NF-κB 水平，RMPP 组高于MPP 组（t＝6.382、9.850，P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患儿血清TLR4、NF-κB表达水平比较Table 2 Comparison of expression levels of TLR4 and NF-κB between the two groups(±s)

表2 两组患儿血清TLR4、NF-κB表达水平比较Table 2 Comparison of expression levels of TLR4 and NF-κB between the two groups(±s)

组别RMPP组MPP组t值P值例数33 36 TLR4/（ng·mL-1）10.43±2.55 6.76±2.22 6.382＜0.05 NF-κB/（pg·mL-1）732.73±119.53 455.73±114.04 9.850＜0.05

2.3 TLR4、NF-κB水平与RMPP的相关性分析

用Pearson 相关分析法分析TLR4 与NF-κB 水平呈正相关，相关系数r=0.610，P＜0.05。见图1。用Spearman 相关性分析法分析，TLR4、NF-κB 与RMPP 呈正相关，相关系数分别是0.642、0.791，均P＜0.05。

图1 TLR4与NF-κB水平散点图Figure 1 Scatter plot of TLR4 and NF-κB levels

2.4 血清中TLR4、NF-κB对RMPP的诊断价值

进一步探讨TLR4、NF-κB 水平对RMPP诊断价值，绘制了ROC 曲线，用Youden 法确定具有诊断RMPP 的最大敏感度和特异度的临界值。当TLR4水平为8.36 ng/mL 时，AUC 为0.871（95%CI：0.792～0.951），其预测敏感度为84.8%，特异度为72.2%。当NF-κB 水平为572.12 pg/mL 时，AUC 为0.957（95%CI：0.916～0.998），其预测RMPP 的敏感度为97.0%，特异度为83.3%。TLR4、NF-κB 两者联合检测，预测RMPP的敏感度为90.9%，特异度为94.4%。见图2，表3。

图2 TLR4、NF-κB及两者联合预测RMPP的ROC曲线Figure 2 ROC curve of TLR4、NF-κB and their combined results for RMPP prediction

表3 TLR4、NF-κB及两者联合预测RMPP分析Table 3 Analyses of TLR4、NF-κB and their combined results for RMPP prediction

2.5 发展为RMPP的多因素logistic回归分析

对两指标进行多因素logistic 回归分析结果显示：血清TLR4＞8.36 ng/mL（OR=1.918，95%CI：1.058～3.479，P=0.032）及NF-κB＞572.12 pg/mL（OR=1.028，95%CI：1.008～1.046，P=0.004）是发展为RMPP的独立危险因素。见表4。

表4 RMPP发生的相关因素logistic回归分析Table 4 Logistic regression analyses of factors related to RMPP

3 讨论

RMPP 可合并严重肺内外并发症，严重影响患儿生命质量。在实际临床中，对RMPP 进行早期诊断并及时规范治疗，对改善预后极为重要[8]。在RMPP的发生发展过程中，免疫机制起着关键作用，表现出强烈的细胞炎症反应及免疫应答[3，9]。支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）细胞膜表面富含脂质相关膜蛋白等，是TLR4 的配体，可跨细胞膜传递信号，触发大量炎症因子释放[10-11]。MP 感染机体，被TLR4 识别，并激活TLR4/NF-κB 信号转导通路，诱导TNF-α、IL-6、IL-8 等多种细胞因子过度表达，造成呼吸道上皮损伤，同时引起不同程度的自身免疫性损害[12-14]。研究[15-17]已证实，TLR4、NF-κB与MP感染肺内外并发症的发生密切相关。

本研究显示，RMPP患儿外周血中TLR4、NF-κB表达水平高于普通MPP组（t=6.382、9.850），差异有统计学意义（P＜0.05），与相关研究[5]结果一致。此结果提示TLR4、NF-κB水平与支原体肺炎严重程度可能存在一定相关性，并参与RMPP发生、进展。多因素logistic 回归分析结果显示：血清TLR4＞8.36 ng/mL、NF-κB＞572.12 pg/mL 时，TLR4、NF-κB 是发展为RMPP 的独立危险因素。TLR4 识别MP 细胞膜表面脂质相关膜蛋白后，激活下游信号分子，如髓样化蛋白等，使相关的蛋白激酶磷酸化，进而活化NF-κB 进入细胞核调控相关基因转录[13-14，18]。TLR4/NF-κB 信号通路在促进炎症反应及导致炎症级联放大中起关键作用[19]。近年来，有研究通过调控TLR4/NF-κB 信号转导通路来改善MP 感染所致的炎症级联反应及组织损伤[20-21]。因此，本研究选择RMPP 患儿血清TLR4、NF-κB 水平为研究切入点，以期寻找更有价值的RMPP 早期预测指标。本研究对数据进行相关性分析显示，TLR4、NF-κB 与RMPP 呈一定的相关性（rs=0.642、0.791，均P＜0.05），提示TLR4、NF-κB 对RMPP 早期有一定预测作用。进而，运用ROC 曲线分析显示，TLR4 值为8.36 ng/mL 时，诊断出RMPP 的敏感度是84.8%，特异度72.2%；当NF-κB 值为572.12 pg/mL 时，诊断出RMPP 的敏感度是97.0%，特异度83.3%。TLR4（AUC=0.871）及NF-κB（AUC=0.957）对RMPP 有一定预测价值。且本研究结果显示：TLR4、NF-κB 联合检测（AUC=0.973）对RMPP 的预测敏感度为90.9%，特异度94.4%。

近年来，通过干预TLR4/NF-κB 信号转导通路来改善和治疗相关疾病已成为研究热点[20-22]。RMPP 患儿早期血清中TLR4、NF-κB 表达水平明显升高，血清TLR4、NF-κB对RMPP有一定预测价值，且两者联合检测诊断价值明显提升，可用于指导临床。TR4、NF-κB 检测成本不高，较宜在临床推广。今后研究期望通过调控TLR4/NF-κB 信号通路证实其能阻止RMPP 的发生发展，使之成为RMPP 临床治疗的新靶点。

综上所述，RMPP 早期患儿血清中TLR4、NF-κB 表达水平增高，对RMPP 的诊断有一定预测价值，且为其独立危险因素。本研究结果为临床早期诊治RMPP提供了依据。