AMPK/MTOR信号通路介导脊髓神经元凋亡在树脂毒素诱导带状疱疹后神经痛中的作用▲

苏 明 张爱民 李 琴 赵 娟 冯鹏玖 黄 倩 秦明秀 黄恒艺

(1 柳州市中医医院麻醉科,广西柳州市 545000; 2 四川省肿瘤医院.研究所,四川省癌症防治中心,电子科技大学附属肿瘤医院麻醉科,四川省成都市 610041; 3 广西医科大学第二附属医院疼痛科,广西南宁市 530007)

带状疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia,PHN)是由水痘-带状疱疹病毒感染引起的疼痛,是临床上常见的神经病理性疼痛[1]。PHN的临床表现主要为痛觉过敏、痛觉异常及自发性疼痛,该病迁延不愈,部分患者甚至终身都受影响。口服药物治疗在一定程度上可改善PHN患者的症状,但长期服药易出现难以耐受的不良反应[2]。而神经阻滞治疗及微创介入治疗需要反复治疗,且因PHN的发生和发展机制尚未完全明确,因此疗效欠佳。我们在前期研究中发现,采用树脂毒素诱导的PHN动物模型的脊髓背角组织中神经元凋亡显著性增加[3],由此推测抑制脊髓背角组织的神经元凋亡可能是治疗PHN的重要切入点[4]。但脊髓中枢在接受外周疼痛信号后,疼痛信号是如何诱导脊髓背角组织的神经元发生凋亡,目前并未完全清楚。

单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是真核细胞的重要能量感受器,单磷酸腺苷/三磷酸腺苷值升高时,处于激活状态的AMPK启动细胞分解代谢、抑制合成代谢[5]。既往研究表明,AMPK不仅可通过调控蛋白翻译、抑制炎症反应、谷氨酸转运体的表达,以及调节神经元的兴奋性等途径来缓解疼痛[6-8],还可通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)磷酸化程度来抑制中枢神经组织的凋亡[9]。但AMPK是否也参与PHN的脊髓组织神经元凋亡过程,目前鲜见有报告。本研究拟在前期研究的基础上,建立树脂毒素诱导的PHN大鼠模型,进一步探讨AMPK/MTOR信号通路在介导PHN大鼠脊髓组织神经元凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只无特定病原体级SD雄性大鼠均由广西医科大学动物实验中心提供(动物许可号:SCXK桂-2014-0002),体重150～200 g,鼠龄3～4个月。由实验中心统一饲养大鼠,喂养环境的温度控制在21 ℃左右,自然昼夜节律,给予大鼠正常饮食、饮水,避免噪声和强光刺激。将所有大鼠适应性喂养3 d后用于实验。本研究已获得广西医科大学动物伦理委员会批准。

1.2 试剂与药品 树脂毒素(Adooq Bioscience公司,批号:57444-62-9),AMPK激动剂阿卡地新(Acadesine,AICAR;Sigma Aldrich Lab &Production Materials公司,批号:HPA021012),兔抗鼠AMPK α2抗体(Abcam公司,批号:ab105028),兔抗鼠磷酸化AMPK α2 (phosphorylated AMPK α2,p-AMPK α2)抗体(Abcam公司,批号:ab23875),兔抗鼠MTOR抗体(Abcam公司,批号:ab134903),兔抗鼠磷酸化MTOR(phosphorylated MTOR,p-MTOR)抗体(Abcam公司,批号:ab63552),兔抗鼠B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗体(Abcam公司,批号:ab182858),兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗体(Abcam公司,批号:ab182733),兔抗鼠Caspase-3抗体(Abcam公司,批号:13847),兔抗鼠GAPDH抗体(Abcam公司,批号:ab8245)。荧光TUNEL试剂盒(Roche公司,批号:TUN11684817),辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG(上海碧云天生物技术有限公司,批号:A0192),二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:P0012),RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司,批号:ml076982),SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:P0012A),PVDF膜(上海碧云天生物技术有限公司,批号:FFP19)。

1.3 实验分组及动物模型的建立 (1)分组:使用SPSS 22.0软件的随机数字发生器将30只SD大鼠分为对照组、PHN组、PHN-AMPK激动组(AICAR组),每组10只。(2)相关药物配置方法:参考文献[10]的方法配置树脂毒素溶液,即将树脂毒素溶解于新鲜配制的吐温80、乙醇和生理盐水混合液中(三者的比例为1 ∶1 ∶8),制成浓度为40 μg/mL的树脂毒素溶液备用。参照说明书配置AICAR,用0.5%二甲基亚砜溶解AICAR后,再用PBS将AICAR稀释为20 mol/L备用。(3)建模及给药方法:除对照组外,参考文献[11]对其余两组大鼠腹腔注射0.2 μg/g的树脂毒素以构建PHN模型,如注射树脂毒素后3 d,与对照组大鼠相比,PHN组与AICAR组大鼠的机械刺激缩足阈值(paw mechanical withdrawal threshold,PMWT)显著下降且热刺激缩足潜伏期(paw thermal withdrawal latency,PTWL)显著延长,则提示建模成功。注射树脂毒素7 d后,给予AICAR组大鼠腹腔注射10 mg/kg的AICAR,给予PHN组大鼠腹腔注射等量的生理盐水,两组给药均为1次/d,连续给药7 d。实验期间正常喂养对照组大鼠,不给予任何干预。

1.4 标本的获取与保存 于给药结束后次日,完成各组大鼠的行为学指标检测后,使用10%水合氯醛麻醉后处死各组大鼠,获取L4～6脊髓组织。将一部分脊髓组织立即放入液氮中速冻30 min后取出并置于-80 ℃冰箱保存备用,将另外一部分脊髓组织使用甲醛固定后行石蜡包埋、制作切片备用。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学指标:参考文献[3],在注射树脂毒素前1 d及注射树脂毒素后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d,分别使用Von Frey纤维丝(Danmic Global公司)检测各组大鼠的PMWT,采用热板法检测大鼠的PTWL。(1)PMWT的检测方法。首先使用0.4 g纤维丝垂直刺激大鼠右侧后爪内侧同一区域皮肤,每次刺激1.5 s,连续3次,每次间隔5 min,若出现嘶吼、舔足、甩尾及弹腿等任一行为则提示该力度阳性,选择小于此力度的下一型号纤维丝刺激,直到刺激出现阴性为止,将此时纤维丝的力度值记为PMWT,当使用在0.07 g的纤维丝刺激时仍为阳性,则统一计数为0.07 g。若使用0.4 g纤维丝刺激时为阴性则选择大于该力度的纤维丝刺激,直到呈现阳性,且将此时的力度值记为PMWT。(2)PTWL的检测方法。将控制面板温度设定为(55.0±0.5)℃进行热板实验。将各组大鼠置于热痛阈检测玻璃透明盒中,待其适应环境后取出大鼠,将玻璃透明盒置于底部为已预热的冷热板痛觉测试仪(安徽耀坤生物科技有限公司,型号:ZL-021)上,再将大鼠放入盒中,按动“start”键,以大鼠舔足、抬足或躲避反应作为疼痛反应指标,当大鼠出现上述反应后立即按动“stop”键以停止测量,记录大鼠自置于热板上至其出现疼痛反应的时间,即为PTWL。

1.5.2 脊髓组织的细胞凋亡情况:参考文献[3]的方法,采用TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。取大鼠L4～6脊髓组织石蜡切片,常规进行脱蜡水化,经蛋白酶K工作液浸泡后使用PBS漂洗。配制TUNEL反应混合液,即将50 μL TdT和450 μL荧光素标记的dUTP液混匀。在切片中滴加100 μL DNase Ⅰ,在37 ℃环境下反应30 min,待玻片干后,滴加50 μL TUNEL反应混合液,加封口膜在湿盒中37 ℃下反应1 h。经PBS漂洗后用抗荧光淬灭封片剂封片,在荧光显微镜(OLYMPUS公司,型号:BX53)100倍镜(激发波长为450～500 nm)下计数5个视野的凋亡细胞数,取平均值。

1.5.3 脊髓组织中相关蛋白的表达量:采用Western blot检测相关蛋白的表达量。取置于-80 ℃冰箱保存的脊髓组织30 mg,加入RIPA裂解液后行超声匀浆,提取总蛋白,采用二喹啉甲酸法检测其浓度。将蛋白煮沸5 min使其变性,取40 μg总蛋白上样后进行SDS-PAGE以分离蛋白,然后将蛋白转移至PVDF膜上,使用5%脱脂牛奶常温封闭膜1 h,分别加入兔抗鼠AMPK α2、p-AMPK α2、MTOR、p-MTOR、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH抗体(稀释比均为1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜后复温30 min,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG(1 ∶2 000)常温孵育2 h,经ECL法显色后,在凝胶成像仪(Bio-Rad公司,型号:12003153)获取蛋白条带, 使用Image Lab软件测量目的蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的灰度值,以两者的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验,重复测量资料采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠PMWT的比较 数据不满足球形分布(P<0.001),故进行Greenhouse-Geisser校正,结果显示,3组大鼠PMWT差异有统计学意义(F组间=207.859,P组间<0.001),PMWT有随时间延长而变化的趋势(F时间=168.380,P时间<0.001),分组与时间有交互效应(F交互=6.895,P交互<0.001)。进一步行分组因素和时间因素的单独效应分析,结果显示,在注射树脂毒素后3～15 d各时间点,PHN组和AICAR组大鼠的PMWT低于对照组,但在注射树脂毒素后9～15 d各时间点,AICAR组大鼠的PMWT高于PHN组(P<0.05);PHN组和AICAR组大鼠在注射树脂毒素后3～7 d各时间点的PMWT低于注射树脂毒素前1 d和注射树脂毒素后1 d的PMWT,但AICAR组大鼠在注射树脂毒素后9～15 d各时间点的PMWT高于注射树脂毒素后3～7 d各时间点的PMWT(P<0.05),见表1。

2.2 3组大鼠PTWL的比较 数据不满足球形分布(P<0.001),故进行Greenhouse-Geisser校正,结果显示,3组大鼠的PTWL差异有统计学意义(F组间=70.789,P组间<0.001),PTWL有随时间延长而变化的趋势(F时间=79.380,P时间<0.001),分组与时间有交互效应(F交互=12.945,P交互<0.001)。进一步行分组因素和时间因素的单独效应分析,结果显示,在注射树脂毒素后3～15 d各时间点,PHN组和AICAR组大鼠的PTWL长于对照组,但在注射树脂毒素后9～15 d各时间点,AICAR组大鼠的PTWL短于PHN组(P<0.05);PHN组和AICAR组大鼠在注射树脂毒素后3～7 d各时间点的PTWL长于注射树脂毒素前1 d和注射树脂毒素后1 d的PTWL,但AICAR组大鼠在注射树脂毒素后9～15 d各时间点的PTWL短于注射树脂毒素后3～7 d各时间点的PTWL(P<0.05),见表2。

表2 在不同时间3组大鼠的PTWL比较(x±s,s)

2.3 3组大鼠脊髓组织凋亡细胞数的比较 与对照组比较,PHN组和AICAR组大鼠的脊髓组织凋亡细胞数增加;与PHN组比较,AICAR组凋亡细胞数减少(P<0.05),见图1、表3。

表3 3组大鼠脊髓组织凋亡细胞数的比较(x±s,个)

图1 3组大鼠脊髓组织的细胞凋亡情况(TUNEL染色,×40)

2.4 3组大鼠脊髓组织p-AMPK/AMPK值、p-MTOR/MTOR值及Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达量的比较 与对照组比较,PHN组和AICAR组大鼠脊髓组织p-AMPK/AMPK值降低,p-MTOR/MTOR值和Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达量增加;与PHN组比较,AICAR组大鼠脊髓组织p-AMPK/AMPK值和Bcl-2的蛋白表达量增加,p-MTOR/MTOR值和Bax、Caspase-3的蛋白表达量降低(P<0.05),见图2和表4。

图2 3组大鼠脊髓组织相关蛋白表达情况的条带图

表4 3组大鼠脊髓组织p-AMPK/AMPK值、p-MTOR/MTOR值及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量的比较(x±s)

3 讨 论

脊髓神经元凋亡是神经病理性疼痛的重要致病机制。既往研究表明,PHN小鼠脊髓组织的过度自噬导致γ-氨基丁酸能神经元的凋亡[3];脉冲射频可通过减少脊髓神经元凋亡,减轻坐骨神经分支损伤模型大鼠的疼痛程度[4]。这提示深入了解脊髓神经元凋亡的分子机制对解释神经病理性疼痛的发病机制具有重要意义。为此,本研究使用树脂毒素诱导建立PHN大鼠模型,以探讨神经病理性疼痛的发病机制。本研究结果显示,在腹腔注射树脂毒素后3 d,大鼠的PMWT降低,PTWL延长,与PHN患者机械疼痛敏化、热痛缺失的临床特征一致,说明成功构建PHN大鼠模型。

研究表明,外周神经损伤后,疼痛刺激持续性传入使脊髓背角神经元的敏感性增加,表现为过度兴奋及伤害性神经元的可塑性改变[12]。此外,MTOR信号通路参与神经病理性疼痛中的脊髓背角突触可塑性调节,是神经源性疼痛时程增长的关键因素[13]。哺乳动物雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,MTORC1)由3种成分组成,分别为MTOR、Raptor和mLST8,与中枢神经系统的多种病理变化相关,其中MTOR是其关键核心成分[14]。研究表明,p-MTOR可通过蛋白激酶B等信号通路诱导神经元凋亡[15]。同时,MTOR在急性疼痛大鼠模型脊髓背角浅表层中表达,这与伤害性疼痛信号传入定位一致[16]。而采用雷帕霉素抑制MTOR的磷酸化后,慢性疼痛超敏反应的启动、建立和维持均受到抑制[17]。因此,MTOR介导的脊髓背角组织神经元凋亡可能是神经病理性疼痛发生的关键机制之一。

降钙素基因相关肽(calcitonin-gene related peptide,CGRP)是C类神经纤维的主要神经递质,通过下调中枢神经系统中的AMPK表达而使机体对神经性疼痛的敏感性增加[18]。研究表明,敲除AMPK可使小鼠出现痛觉过敏行为,使用AMPK激活剂后可以显著缓解神经病理性疼痛中背根神经节感觉神经元的电兴奋性[19]。有学者发现,在采用白藜芦醇激活AMPK后,背根神经节和脊髓背角组织中神经元MTORC1信号传导受阻,切口损伤引起的机械性超敏反应也降低[20],这表明AMPK和MTOR是治疗神经病理性疼痛的潜在新靶点。本研究中,PHN大鼠出现机械疼痛敏化和热痛缺失,脊髓组织凋亡细胞数增加,且AMPK磷酸化水平降低,MTOR的磷酸化水平增加,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达上调;而采用AICAR激活AMPK后,PHN大鼠的机械疼痛敏化和热疼痛缺失均得到改善,脊髓组织凋亡细胞数减少,且AMPK磷酸化水平升高、MTOR磷酸化水平降低,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达受到抑制,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加。因此,推测AMPK/MTOR信号通路可能参与PHN大鼠脊髓背角组织神经元凋亡的过程,激活脊髓背角组织AMPK的表达或将成为治疗神经病理性疼痛的潜在靶点。

综上所述,刺激AMPK发生磷酸化后,PHN大鼠的机械疼痛敏化和热疼痛缺失得到改善,脊髓组织MTOR磷酸化水平降低、神经元细胞凋亡受到抑制,AMPK/MTOR信号通路可能参与PHN大鼠脊髓背角组织神经元凋亡的过程。本研究结果为PHN中的脊髓神经元凋亡机制及干预靶点研究提供了新思路。但本研究仅使用了AMPK的激活剂,未分别使用AMPK抑制剂、MTOR激活剂与抑制剂进一步观察其对PHN大鼠行为学指标的影响,今后将完善实验设计以深入研究相关机制。