缺血性脑卒中患者的外周血CDC42表达水平、炎症相关Th和细胞因子水平及其与神经功能缺损、焦虑/抑郁及认知功能障碍程度的相关性▲

贾聚娟 马海峰 郝 光

(河北北方学院附属第一医院神经内科,河北省张家口市 075000)

缺血性脑卒中是指脑局部血液循环异常引起的神经功能受损性疾病,该病有较高的伤残率、复发率、病死率等,对患者健康造成严重影响[1]。缺血性脑卒中是脑卒中最常见的一种类型,发病人群主要为老年人群。虽然目前临床上缺血性脑卒中的治疗水平不断提高,患者病死率明显下降,但脑卒中后遗症的发生率仍较高,可严重影响患者的生活水平,加重患者的心理压力及医疗负担。缺血性脑卒中患者常会出现认知功能障碍,表现为计算、执行、言语、记忆及判断理解等能力受损[2]。此外,缺血性脑卒中患者还可并发焦虑/抑郁,其发生率约为40%,可影响患者治疗的配合度及效果[3]。

缺血性脑卒中发生的影响因素较多,发病机制相对复杂,其中炎症反应可能在缺血性脑卒中的发生、发展中发挥一定作用。炎症反应的发生涉及多种细胞因子及免疫细胞。其中,细胞分裂周期蛋白42(cell division cyclin 42,CDC42)是重要的免疫调节因子,不但可促进神经干细胞/祖细胞迁移而利于脑损伤组织的修复,还可促使中性粒细胞发生迁移,甚至诱导其极化表型的转化[4]。Th17可通过合成并分泌白细胞介素(interleukin,IL)-6等细胞因子而介导炎症反应,且在肿瘤、感染、自身免疫性疾病等的发生与发展过程中起重要作用[5];Th1可有效刺激及介导细胞免疫反应,其可分泌IL-2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎症因子,与神经退行性疾病密切相关;Th2则具有促进体液免疫的作用,其可下调Th1的活性,分泌IL-10、IL-5等抗炎因子[6-7]。基于此,本文探讨缺血性脑卒中患者的外周血CDC42表达水平、炎症相关Th(Th1、Th2、Th17)及细胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α)水平,并分析上述指标与神经功能缺损、焦虑/抑郁及认知功能障碍程度之间的关系,了解上述指标与缺血性脑卒中发生、发展的关系,以期为该病的临床干预提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021年12月至2022年12月于我院神经内科住院的200例缺血性脑卒中患者作为观察组。纳入标准:(1)至少伴有1种脑血管疾病高危因素(如糖尿病、高血压、肥胖、高脂血症等),且经头颅CT或MRI诊断为新发脑梗死病灶;(2)局灶性脑神经功能损伤持续时间>24 h;(3)疾病发作后24 h内入院;(4)年龄>18岁。排除标准:(1)伴有颅内出血的患者;(2)伴有较严重的自身免疫性疾病、感染、炎症等患者;(3)无法配合完成神经心理学评估的患者;(4)服用抗精神病药物者或既往存在精神类疾病的患者;(5)存在血液系统恶性肿瘤或是其他肿瘤病史者;(6)存在滥用具有依赖性的药物、酒精依赖症者。另选取同期在我院体检中心体检的200例健康体检者作为对照组。两组的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。两组研究对象均对本研究知情并签署知情同意书。本研究经我院医学伦理委员会批准,并遵循赫尔辛基宣言及相应的规章制度。

表1 两组一般临床资料的比较

1.2 相关指标的检测方法 分别抽取观察组入院时、对照组体检时晨起空腹状态下的外周静脉血6 mL,取3 mL血标本用于检测Th1、Th2及Th17水平。取剩余3 mL血标本静置30 min后,于4 ℃条件下以3 000 r/min离心20 min,提取上清液,置于-80 ℃冰箱保存,用于检测CDC42 mRNA表达水平和细胞因子水平。

1.2.1 CDC42 mRNA表达水平的检测:根据RNA提取试剂(北京百奥莱博科技有限公司,货号:WE0193)、反转录试剂(江苏开锐生物医药科技有限公司,货号:KRSJH039)说明书,提取血标本RNA后进行反转录获得cDNA。以GAPDH为内参,使用实时荧光定量PCR试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:Q222-01)及实时荧光定量 PCR系统(Life Technologies公司,型号:QuantStudioTM6 Pro)进行PCR扩增。CDC42上游引物序列为5′-GATACTCACTTTTTGCGGTCT-3′,下游引物序列为5′-ATGTAGGAAGTGCCAGAGCC-3′;GAPDH上游引物序列为5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游引物序列为5′-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3′。反应体系包括上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、SYBR Green 10 μL,加蒸馏水至20 μL。反应条件为95 ℃ 7 min;93 ℃ 25 s、66 ℃ 30 s、74 ℃ 13 min,共40个循环。采用2-△△Ct法计算CDC42的mRNA表达水平。

1.2.2 Th1、Th2、Th17水平的检测:按1 ∶1比例将3 mL外周静脉血与RPMI-1640培养基(武汉赛奥斯生物科技有限公司,货号:MED-1029)混合均匀,添加10 mg激活剂佛波酯[翌圣生物科技(上海)股份有限公司,货号:50601ES03],加入2 μg/mL高尔基体阻断剂[和元生物技术(上海)股份有限公司,货号:AC14L343]与10 mg/mL离子霉素(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT05990),于4 ℃下过夜培养,将细胞收集于流式管,离心(3 500 r/min离心15 min)后提取上清液,加入异硫氰酸荧光素标记的抗人CD4单抗(湖南合创思医疗科技有限公司,湘长械备20221348号),室温、避光下静置0.5 h,固定、破膜后,加入藻红蛋白标记的人抗小鼠γ干扰素单克隆抗体(上海联迈生物工程有限公司,货号:LM-11425-ES)、异硫氰酸荧光素标记的人抗小鼠IL-4单克隆抗体(上海羽朵生物科技有限公司,货号:YDLC-9033)、藻红蛋白标记的抗IL-17单克隆抗体(武汉艾美捷科技有限公司,货号:AAT-2558),最后使用流式细胞仪[艾森生物(杭州)有限公司,型号:NovoCyte 2060R]检测Th1、Th2及Th17水平。

1.2.3 IL-6、IL-10、TNF-α水平的检测:采用ELISA检测血清IL-6、IL-10、TNF-α水平,按照试剂盒说明书的操作步骤进行检测。IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA检测试剂盒均购于武汉艾美捷科技有限公司,货号分别为RP0870H-500、RD194572200R、3512-1HP-2。

1.3 缺血性脑卒中患者神经功能缺损程度的评估 于入院当天由具有5年及以上临床经验的主治医师,采用美国国立卫生院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)[8]评估患者的神经功能缺损程度。该量表包括意识水平、意识水平指令、意识水平提问、视野、凝视、上肢及下肢运动、语言、感觉、共济失调、忽视症、构音异常11项内容,每项内容按不同严重程度计为0～2分或0～4分,无法实施的项目计为9分并注明原因。该量表总分范围为0～42分,总分越高表示患者的神经功能缺损越严重,其中<4分为轻度神经功能缺损,4～15分为中度神经功能缺损,>15分为重度神经功能缺损。

1.4 缺血性脑卒中患者焦虑/抑郁情况的评估 入院当天由具有5年及以上临床经验的主治医师,分别采用焦虑自评量表(Self-Rating Anxiety Scale,SAS)及抑郁自评量表(Self-Rating Depression Scale,SDS)[9]评估患者的焦虑/抑郁情况。其中,SAS包含20项内容,其中正向评分有15项,负向评分有5项,每项内容均采用4级评分法(1～4分)进行评分,总分越高者焦虑情况越严重,其中50～59分为轻度焦虑,60～69分为中度焦虑,≥70分为重度焦虑。SDS包含20项内容,正向评分及反向评分的项目各10个,每项内容均采用4级评分法(1～4分)进行评分,总分越高者抑郁情况越严重,其中53～62分为轻度抑郁,63～72分为中度抑郁,≥73分为重度抑郁。

1.5 缺血性脑卒中患者认知功能障碍程度的评估 入院当天由具有5年及以上临床经验的主治医师,采用简易智力状况检查(Mini Mental State Examination,MMSE)量表[10]评估患者的认知功能障碍程度。该量表包括意识水平、注意与计算能力、语言能力、学习与记忆力能力、空间与时间定向5项内容。该量表总分范围为30分,总分越高表示患者的认知功能越好,其中26～30分为正常,20～25分为轻度认知功能障碍,10～19分为中度认知功能障碍,0～9分为重度认知功能障碍。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验;计数资料以例数(百分比)表示,组间比较采用χ2检验;采用Pearson检验进行相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象CDC42 mRNA表达水平、炎症相关Th及细胞因子水平的比较 观察组的IL-6、TNF-α、Th1、Th17水平高于对照组,而CDC42 mRNA表达水平及Th2、IL-10水平低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组研究对象CDC42 mRNA表达水平、炎症相关Th及细胞因子水平的比较 (x±s)

2.2 观察组患者的CDC42 mRNA表达水平、炎症相关Th及细胞因子水平与NIHSS评分、SAS评分、SDS评分、MMSE量表评分的相关性 观察组的NIHSS评分、SAS评分、SDS评分、MMSE量表评分分别为(20.57±3.26)分、(71.34±4.23)分、(75.06±5.18)分、(17.15±2.14)分。Th1、Th17、IL-6、TNF-α水平与NIHSS评分、SAS评分、SDS评分呈正相关,与MMSE量表评分呈负相关(P<0.05);而CDC42 mRNA表达水平及IL-10、Th2水平与NIHSS评分、SAS评分、SDS评分呈负相关,与MMSE量表评分呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 观察组患者的CDC42 mRNA表达水平、炎症相关Th及细胞因子水平与NIHSS评分、SAS评分、SDS评分、MMSE量表评分的相关性

3 讨 论

脑卒中为病死率较高的疾病,约有70%的脑卒中为缺血性脑卒中,多数缺血性脑卒中患者易出现不同程度的神经功能缺损和认知功能障碍,其中认知功能障碍表现为记忆、行为、注意、执行、视觉等能力下降,严重影响患者的日常生活[11-12]。虽然常规治疗缺血性脑卒中的药物可在一定程度上改善患者的相关临床症状,但部分患者的神经功能无法恢复至正常状态,还有部分患者患病后极易出现焦虑/抑郁等不良情绪,对其病情恢复造成一定影响[13]。

炎症反应及免疫反应是影响缺血性脑卒中发生的重要因素,且外周免疫细胞及胶质细胞参与调节缺血性脑卒中的炎症反应[14]。脑卒中发生后可激活机体炎症级联反应,引起局部和/或全身性免疫反应,进一步加剧脑组织损伤[15]。CDC42属于鸟嘌呤三核苷酸酶,是重要的免疫调节因子。CDC42参与神经细胞迁移及生长过程的调控,为缺血半暗带的潜在血清标志物,而缺血/再灌注又可明显改变CDC42的活性[16]。研究显示,在认知功能障碍发病机制中,T淋巴细胞起到一定作用[17-18]。CD4+T淋巴细胞可分化成不同亚群的Th,其中Th1、Th2可互相影响,通过分泌特异性细胞因子发挥免疫调节及炎症调控的作用。Th1主要分泌IL-2、TNF-α、γ干扰素等细胞因子,在炎症反应中发挥重要作用;Th2主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子,具有抗炎作用[19-20]。Th17为Th的亚群之一,可分泌IL-17、IL-23、IL-6及TNF-α等促炎因子,具有较强的促炎作用,在炎症性疾病的发生、发展中起到重要作用[21]。同时,Th17可与调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)互相影响、互相拮抗。Treg可抑制免疫反应过度激活,发挥保护神经的作用[22],其数量减少可提高炎症细胞因子的表达水平与大脑小胶质细胞的数量,导致Th17数量增加,而Th17数量增加又可抑制Treg分化,加重炎症反应,从而加重脑部损伤[23]。本研究结果显示,观察组的Th1、Th17、IL-6、TNF-α水平高于对照组,而Th2、IL-10水平及CDC42 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。这提示缺血性脑卒中患者的外周血促炎性Th及细胞因子水平升高,而抗炎性Th及细胞因子水平降低,CDC42表达水平下调,动态监测上述指标可能有助于评估缺血性脑卒中患者的病情。

本研究结果还显示,观察组的Th1、Th17、IL-6、TNF-α水平与NIHSS评分、SAS评分、SDS评分呈正相关,与MMSE量表评分呈负相关(P<0.05);而IL-10、Th2水平及CDC42 mRNA表达水平与NIHSS评分、SAS评分、SDS评分呈负相关,与MMSE量表评分呈正相关(P<0.05)。这说明外周血促炎性Th及细胞因子水平越高,而抗炎性Th及细胞因子水平、CDC42 mRNA表达水平越低,缺血性脑卒中患者的神经功能缺损、焦虑/抑郁、认知功能障碍程度越严重。其原因可能为炎症反应及免疫反应在缺血性脑卒中的发生及发展中发挥重要作用,而上述免疫细胞及因子的表达异常,可加重炎症反应及免疫紊乱,进而促进缺血性脑卒中患者的病情进展,诱发或加重认知功能障碍、焦虑/抑郁等并发症。

综上所述,缺血性脑卒中患者外周血促炎性Th(Th1、Th17)及细胞因子(IL-6、TNF-α)水平升高,而抗炎性Th(Th2)及细胞因子(IL-10)水平降低,免疫调节因子CDC42表达水平下调,上述指标可在一定程度上反映患者的神经功能缺损、焦虑/抑郁及认知功能障碍程度,有助于监测患者的病情程度及进展情况。