多组学分析在昆虫滞育中的应用

类晶晶,公茂庆,刘丽娟

(山东省寄生虫病防治研究所医学昆虫学部,山东第一医科大学(山东省医学科学院),山东济宁 272033)

组学是把与研究目标相关的所有因素综合在一起,作为一个“系统”来研究,是基于整体角度对某一组分的研究和评估(Hasinetal., 2017);包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等,各组学之间既相互独立又具有联系,通过转录组学、蛋白质组学以及代谢组学技术,将昆虫研究中的问题展现在基因、蛋白质和代谢物三个不同层次水平上,有利于进一步探索和研究昆虫发育中的各项问题。当前组学技术已成为解读昆虫发育过程的新工具,为昆虫尤其是害虫的预防和控制奠定了重要的理论基础。

滞育是昆虫为应对光周期、温度等环境因素变化而进入停滞发育的一种休眠形式,是一种适应性和可塑性的表型,也是昆虫在不良环境下得以生存、繁衍和进化的一大重要特征(Raglandetal., 2019; 姜春艳等,2021)。昆虫滞育过程主要包含三个阶段,即滞育前期、滞育期和滞育后期(Kostál, 2006),且不同昆虫的滞育发生时期有所差异,即可能出现在卵、幼虫或若虫、蛹或成虫阶段(Koštáletal., 2017; Hutfilz, 2022)。单一组学研究结果可以从某一层面解释滞育调控的分子机制,但尚不能系统全面的阐明其间的具体因果关系。进入后基因组学时代,转录组学、蛋白质组学和代谢组学等功能性“组学”技术为深入了解昆虫滞育提供了更为有效的方法;多组学分析是以中心法则为基础,综合两种以上组学数据进行的比较关联分析,利用不同组学水平分析结果间的相关性实现对单一数据的整合和深入分析,并在不同层面得到补充和印证,即更精准的确定与滞育相关的差异基因、蛋白质和代谢标志物,有助于进一步完善昆虫滞育的分子调控网络。

本文主要综述了组学以及多组学技术在昆虫滞育及其相关生理生化过程中的应用,有助于更加深入了解昆虫生命活动规律,为进一步探明昆虫对当前环境的适应机制以及探索害虫有效防制措施提供理论依据。

1 各组学技术在昆虫滞育中的应用

1.1 转录组学

转录组学是从RNA水平上对转录及转录调控规律的研究,其分析方法依托于分子杂交技术和测序技术。现今,转录组学技术已在多种昆虫滞育调控机制的研究中应用(Zhaoetal., 2016; Dengetal., 2018; 刘敏,2020;孟佳和黄建,2022;赵娜等,2022)。研究者对不同发育时期的昆虫进行高通量测序,获得昆虫全部生命时期的动态转录谱,为昆虫尤其是害虫的预防和控制奠定了重要的理论基础(杨帆等,2014)。对同一昆虫滞育与非滞育阶段进行转录组学分析比较,以获得滞育相关差异基因,从转录水平阐释该昆虫的滞育调控机制(张博等,2020;李艳艳等,2021)。此外,通过转录组学技术也可验证一些激素或者基因在昆虫滞育过程中发挥的作用或者参与的具体的调节机制(Duetal., 2022; 姚知含等,2022)。随着下一代测序技术的发展,RNA-Seq技术已成为在转录组水平上分析差异基因表达不可缺少的工具。Christine Merlin课题组借助RNA-seq等方法对北美帝王蝶Danausplexippus的生物钟基因及昼夜节律系统进行了深入的研究(Iiamsetal., 2019; Lugenaetal., 2019),获得帝王蝶滞育分子机制的重要信息;Poupardin等人(2015)同样采用RNA-seq技术对缘吸汁果蝇Chymomyzacostata幼虫滞育分析发现短光照触发滞育与光周期敏感阶段20-羟基蜕皮酮信号通路的抑制有关。借助转录组学技术,人们对昆虫的滞育行为有了更为丰富和客观的认识。

1.2 蛋白质组学

蛋白质组学是以细胞、组织或生物体蛋白质的组成及其变化规律为主要内容的研究(Wilkinsetal., 1996),目前多借助于双向凝胶电泳、iTRAQ/TMT定量蛋白质组学分析、等电聚焦及生物质谱分析等技术手段对蛋白质进行功能鉴别和分类。与滞育相关联的蛋白在滞育期可特异表达,多以储藏蛋白、抗冻蛋白、热休克蛋白、分子伴侣或其他重要的代谢调节酶类物质形式存在,在昆虫适应及抵抗逆境胁迫的过程中发挥重要作用(张礼生等,2015)。现有文献大多采用比较蛋白质组学技术,再结合质谱及生物信息学方法,对滞育期和非滞育期的昆虫进行比较,获得与滞育相关联的蛋白,如黄凤霞等人(2015)利用iTRAQ技术结合生物信息学分析方法对烟蚜茧蜂Aphidiusgifuensis滞育前期及滞育期进行分析,获得与脂代谢相关的蛋白有脂质运载/胞质脂肪酸结合蛋白(gi322794737)、C型凝集素(gi607305114)、肽基脯氨酰顺反异构酶(W4X351_ATTCE)以及芳基贮存蛋白α亚基(gi332018934)等;Liu等人(2022)利用TMT蛋白定量技术联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析技术揭示欧洲熊蜂Bombusterrestris的滞育发生机制。此外蛋白质组学技术在鞘翅目(七星瓢虫Coccinellaseptempunctata、沙葱萤叶甲Galerucadaurica)、双翅目(伞裙追寄蝇Exoristacivilis、淡色库蚊Culexpipienspallens)及膜翅目(茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebustestaceipes)等昆虫中均有所应用(刘遥,2014;Maetal., 2019; 张倩等,2019;刘敏,2020;韩海斌等,2021)。

1.3 代谢组学

代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定性定量分析的一门学科,是继转录组学和蛋白质组学技术后的一项新技术,常采用核磁共振、质谱、色谱及色谱质谱联用等方法。代谢是基因与表型之间的重要桥梁,基于代谢层面的组学分析可通过筛选滞育相关差异代谢物,从代谢角度分析昆虫的滞育调节分子机制,而这种调节多与昆虫的抗寒性有关。如Li等人(2015)研究发现滞育和非滞育寄生蜂的代谢谱中多种冷冻保护剂、氨基酸和碳水化合物的水平有显著差异,且宿主滞育状态也对寄生蜂的代谢特征产生显著影响;Koštál等人(2016)发现黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的高抗冻性与参与精氨酸和脯氨酸代谢的高水平氨基酸化合物密切相关;昆虫滞育期产生的一些代谢产物除了起冷冻保护剂的作用,还可能兼具代谢时钟或时间保持器的调节作用(Lehmannetal., 2018)。

近年来组学分析技术在昆虫滞育中的应用研究列于表1。无论是转录组学、蛋白质组学还是代谢组学,在昆虫滞育研究中都起到了不可忽视的作用,但单一组学研究结果往往局限于某一水平层次中,系统性和全面性不足,可能需要多个组学数据间的相互印证和补充以及更深层次的研究;此外样本所处的滞育或生长发育阶段及质量也与组学分析结果息息相关。

2 多组学联合分析在昆虫滞育中的应用

2.1 转录组学与蛋白质组学联合分析

虽然转录组学基于mRNA转录水平,蛋白质组学基于蛋白质翻译水平,但两者均用来展现基因的表达情况。将从两者筛选得到的差异基因和蛋白质进行通路富集,一方面可以有效提高蛋白的鉴定数量,另一方面也可以从蛋白水平对转录基因的突变信息进行验证。因此蛋白质组学常与转录组学进行联合分析,筛选出大量可能与昆虫滞育相关的基因和蛋白(Maetal., 2019),用以描述生物功能因果关系的完整性。

目前,转录组学与蛋白质组学联合分析主要应用于鞘翅目、鳞翅目、双翅目以及膜翅目昆虫中,尤其在越冬昆虫的研究中应用较多。以滞育状态越冬的昆虫面临诸多挑战,一方面食物短缺难以弥补能量的消耗,迫使该环境下生存的昆虫储备大量的物质能量以维持这一阶段的正常生命活动;另一方面为抵御低温的迫害,促使体内产生低温保护剂提高抗寒性,缓解或修复冷损伤(Teetsetal., 2023)。因此滞育期的特异基因和特异蛋白主要与碳水化合物、蛋白质和脂质等生化代谢途径相关联。刘敏等人(2020)利用转录组与蛋白质组联合分析,证实茶足柄瘤蚜茧蜂滞育相关基因和蛋白主要影响该昆虫的碳水化合物、脂质和能量代谢以及蛋白质翻译等生物过程;中华通草蛉Chrysoperlasinica和日本通草蛉Chrysoperlanipponensis的转录组和蛋白质组分析结果也证实滞育相关基因和蛋白主要参与脂质和碳水化合物代谢途径,富集的代谢通路多与脂类和碳水化合物相关(赵月明,2021;Chenetal., 2023)。另外,转录组学和蛋白质组学联合分析常应用于昆虫的生殖滞育研究中,Ma等人(2021)应用基因克隆和RNAi技术证实了保幼激素JH信号通路在沙葱萤叶甲生殖滞育中起着重要的调控作用;Yang等人(2020)发现大豆荚螟Etiellazinckenella与脂肪酸生物合成和长寿调控相关的基因在滞育幼虫中表达上调,而在新发育的蛹中表达下调。转录组学和蛋白质组学联合分析在二斑叶螨Tetranychusurticae、烟蚜茧蜂等的生殖滞育研究中也有新的发现(Qiuetal., 2016; Zhaoetal., 2017)。此外,利用转录组学和蛋白质组学联合分析,证实昆虫激素通过代谢相关基因的转录调节昆虫的滞育,如谈倩倩等人(2016)运用转录组学和蛋白质组学技术证实保幼激素参与调节滞育前脂质积累、对抗逆基因的表达以及体内的含水量,在大猿叶虫滞育中发挥了重要作用。

2.2 转录组学和代谢组学联合分析

代谢组学是转录组学的延伸,可为转录组学提供更加表观显著的数据支持,基因的功能性变化最终会体现在代谢层面,而代谢物可以放大这些基因在功能水平的表达,两者联合分析使结果更加明确的同时也让检测更为便捷。昆虫的滞育及滞育解除过程都离不开糖类、脂质和蛋白质等能量和营养物质的加持,即滞育阶段的差异基因及差异代谢物多与抗逆性以及抵抗力的提高有关。

滞育与非滞育状态下昆虫的物质代谢通路存在明显的差异性,富集通路主要集中分布在物质的合成和分解方面,甚至会开辟出新的代谢通路(Hahnand Denlinger, 2011; 刘遥,2014)。

转录组学与代谢组学技术联合分析在鞘翅目、双翅目和膜翅目昆虫中有所应用。李媛媛等(2022)在转录和代谢水平上对滞育与非滞育伞裙追寄蝇蛹期进行组学分析,获得7 513个差异基因和501个差异代谢物,主要参与氨基酸代谢、神经和消化系统以及信号转导途径;刘敏(2020)研究结果表明茶足柄瘤蚜茧蜂滞育相关基因和代谢物在正离子模式下主要富集通路为氨基酸、脂以及核苷酸代谢通路,在负离子模式下,两者仅富集到半乳糖代谢通路。转录组学与代谢组学联合分析往往结合生物信息学的方法,如王攀(2020)利用核磁共振技术分析了柑橘大实蝇Bactroceraminax滞育与非滞育蛹的代谢谱,通过GO分类分析和KEGG分析,结果发现21种显著差异代谢物多与三羧酸循环和抗寒性机制相关,成功注释的序列多与细胞过程、结合及催化活性相关,KEGG数据库中被注释的通路以信号转导相关数量最多;另一对柑橘大实蝇蛹滞育的分析显示,4 808个差异基因主要参与代谢和信号转导以及内分泌系统和消化系统过程,作为温度保护剂的脯氨酸和海藻糖在柑橘大实蝇的滞育调控中发挥重要作用(Wangetal., 2017)。此外Moos等人(2022)通过转录组学与代谢组学技术证实缘吸汁果蝇的食物摄入是碳骨架的重要来源,可直接同化或代谢转化为昆虫应对滞育和寒冷的冷冻保护剂。

2.3 蛋白质组学和代谢组学联合分析

蛋白质组学和代谢组学的联合分析在昆虫中的应用实例相对较少,在昆虫滞育层面相关的文献少之又少。两者联合分析的案例虽然不多,但研究结果提供了有价值的数据资料.如棉铃虫Helicoverpaarmigera幼虫血淋巴和脑的平行蛋白质组学和代谢组学联合分析实验,共获得37个差异表达蛋白和22个差异代谢物,大脑中则均获得49种差异蛋白和代谢物,其中两实验中分别有28种和37种差异蛋白质被成功鉴定,为棉铃虫滞育分子机制阐明提供了线索(Zhangetal., 2012; 2013)。翼蚜外茧蜂Praonvolucre在滞育期间会积累高水平的山梨糖醇等低温保护物质,多种蛋白质也在这一时期发挥调节作用,包括具有细胞骨架和角质层的重塑、胁迫耐受性、蛋白质周转、脂质代谢和各种代谢酶等功能的蛋白质(Colinetetal., 2012)。

多组学技术的联合应用有效避免了单一组学的局限性,通过多个组学间的内在联系,将基因、蛋白质和代谢物三个维度间的信息优势互补,更具全面性和系统性,有助于推进和完善昆虫滞育调控的分子机制,为益虫的生存和害虫的控制带来新突破。表2为多组学技术联合分析在昆虫滞育研究中的案例。

表2 多组学分析技术在昆虫滞育中的应用举例

3 小结与展望

滞育是昆虫应对不良环境条件暂时停止生长发育的现象,为昆虫的生存、繁衍和进化提供有利的保障。近年来,人们对昆虫滞育的研究愈加深入,组学技术的发展极大地促进了昆虫滞育调控分子机制研究工作的进步,通过单组学和多组学联合分析等技术,现已对部分昆虫的滞育机制有了突破性的研究进展。但相关的工作大多缺乏功能性验证,即通过组学对滞育差异基因、蛋白或代谢物进行初步分析和筛选,未对其进一步验证和挖掘,且多组学分析结果离不开生物信息学分析结果的辅助,单一组学本身及组学数据间的整合仍然存在困难(Maoetal., 2019)。因此,想要真正解决昆虫滞育研究中的问题,未来的研究一方面需要在不同组学数据间的整合方面做深入工作,以进一步加强组学间的联合应用;另一方面在开展多组学分析工作的同时应该进一步加强其与功能验证分析的联合应用,即通过组学分析获得参与昆虫滞育调控的候选基因、蛋白或者代谢物,继而利用RNAi、CRISPR基因编辑、以及经典的分子生物学方法和技术等方式,明确候选基因、蛋白和代谢物的功能和参与调节滞育的深层机制。