乳腺癌-抑郁症关联基因筛选与中药预测的生物信息学研究

李丹云 蓝婉宁 袁泽焕 廖秋华 陈彦彤 郑锦湖 曹 阳

(1 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海市 200000;广州中医药大学2 第一临床医学院,3 第二临床医学院,4 第三临床医学院,广东省广州市 510405)

乳腺癌是临床上较为常见的癌症,同时也是导致女性死亡的主要原因之一[1]。世界卫生组织国际癌症研究机构发布的最新数据显示,2020年全球乳腺癌新发病例首次超越肺癌,成为全球第一大癌[2]。心理健康是乳腺癌诊断和治疗过程中医生与患者关注的重点[3]。研究表明,相较于其他恶性肿瘤患者,乳腺癌患者的抑郁症发生率更高[4]。而抑郁、焦虑等不良情绪的发生会降低乳腺癌患者治疗的依从性与效果,影响患者的生活质量及预后[5],甚至增加患者的死亡率[6]。因此,早期诊断乳腺癌并发抑郁症并给予治疗,对改善患者预后具有重要的临床意义。目前,乳腺癌并发抑郁症并无特效药物,多是在乳腺癌治疗的基础上服用抗抑郁药物,但这容易引起患者食欲减退、恶心、呕吐、血细胞减少等不良反应[7]。中医学认为乳腺癌并发抑郁症多属“郁病”范畴,其发生主要与肝气郁结有关,中医药防治可发挥整体调治、辨证论治的优势[8-9]。本研究利用生物信息学方法,识别特定、敏感和可靠的乳腺癌-抑郁症关联基因及其涉及的相关信号通路,挖掘潜在治疗中药,为乳腺癌并发抑郁症患者的早期诊断、治疗与预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中查找并筛选得到两个数据集GSE70905和GSE98793,两个数据集均以血液样本作为检测样本,且同时具有病变组织样本及正常对照组织样本,样本的物种来源均为人。GSE70905数据集包括47例乳腺癌组织样本和47例正常对照组织样本,其来源平台为GPL4133 Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F(Feature Number version)。GSE98793数据集包括128例重度抑郁症患者血液样本和64例正常对照人群血液样本,其来源平台为GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 差异表达基因的筛选 使用在线分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分别筛选上述2个数据集中乳腺癌组织样本和正常对照组织样本之间、重度抑郁症患者血液样本和正常对照人群血液样本之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),设置筛选条件为|log2FC|≥1、P值≤0.05,采用SangerBox软件绘制DEGs的火山图和热图。运用Draw Venn Diagram在线软件对上述2个数据集的DEGs制作Venn图,获取乳腺癌-抑郁症关联基因用于后续分析。

1.3 乳腺癌-抑郁症关联基因的富集分析 利用在线分析工具DAVID(http://david.ncifcrf.gov)对乳腺癌-抑郁症关联基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析,以了解其分子功能、参与的生物学过程及涉及的细胞组分,并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作为筛选条件。使用在线云平台OmicShare(www.omicshare.com/tools)对分析结果进行可视化处理。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建及关键基因的分析 将乳腺癌-抑郁症关联基因导入STRING数据库(https://string-db.org/),设置“Organism”为“Homo sapiens”,“最低相互作用阈值”选择“最高置信度(0.900)”,隐藏网络中无关联的靶标基因,其余参数选取默认值,得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络信息。运用Cytoscape 3.7.2软件进一步可视化处理PPI网络,并在PPI网络中通过MCODE插件筛选关键基因,筛选条件为MCODE score>16、degree cut-off=2、node score cut-off=0.2、Max depth=100、k score=2。在GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)中分析关键基因在乳腺癌组织中的mRNA表达水平;利用在线数据库Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)进行生存分析(选择“mRNA-gene chip”),根据关键基因的mRNA表达水平中位数将乳腺癌患者分为高表达组和低表达组,采用log-rank检验比较两组生存曲线的差异(其他参数为默认值),以P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 关键基因映射及中药预测 在Coremine Medical数据库(http://www.coremine.com/)中对关键基因进行映射,筛选出与关键基因相关的中药。

2 结 果

2.1 DEGs及乳腺癌-抑郁症关联基因 共得到5 005个乳腺癌相关DEGs及1 680个抑郁症相关DEGs,将两者取交集得到281个乳腺癌-抑郁症关联基因,见图1、图2、图3。

图1 DEGs的火山图

图2 DEGs的热图

图3 Venn图

2.2 乳腺癌-抑郁症关联基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果 GO功能富集分析结果表明,乳腺癌-抑郁症关联基因的分子功能主要表现在蛋白磷酸酶结合、三磷酸腺苷酶活性、多聚腺嘌呤核糖核苷酸结合等,参与的生物学过程主要为血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)信号通路、白细胞迁移、一氧化氮生物合成过程的正调控、对缺氧的反应、白细胞介素10产生的正调控等,涉及的细胞组分主要为细胞表面、细胞支架、胞质液等,见表1。KEGG通路富集分析结果表明,乳腺癌-抑郁症关联基因主要富集在IgE-FC片段受体(Fc fragment of IgE receptor,FcεRI)信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、白细胞跨内皮迁移信号通路、Rap1信号通路、鞘磷脂信号通路等,见图4。

表1 乳腺癌-抑郁症关联基因的GO功能富集分析结果

图4 乳腺癌-抑郁症关联基因的KEGG通路富集分析气泡图

2.3 关键基因的筛选及分析结果 通过STRING数据库及Cytoscape 3.7.2软件构建乳腺癌-抑郁症关联基因的PPI网络后,使用Cytoscape 3.7.2软件的MCODE插件寻找PPI 网络中密集连接的区域,得到功能模块最大者由16个节点和120条边组成,共得到16个关键基因,包括毒蕈碱型胆碱受体(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)2、CHRM4、C-X-C基序趋化因子配体(C-X-C motif chemokine ligand,CXCL)2、CXCL8、CXCL10、CXCL11、α2肾上腺素受体(adrenoceptor alpha 2,ADRA2)C、ADRA2A、ADRA2B、前列腺素E受体3(prostaglandin E receptor 3,PTGER3)、5-羟色胺受体1B(5-hydroxytryptamine receptor 1B,HTR1B)、γ-氨基丁酸B型受体亚单位1(gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1,GABBR1)、μ1鸦片受体(opioid receptor mu 1,OPRM1)、δ1鸦片受体(opioid receptor delta 1,OPRD1)、D2多巴胺受体(dopamine receptor D2,DRD2)、D3多巴胺受体(dopamine receptor D3,DRD3),见图5。

图5 关键基因的PPI网络图

利用GEPIA网站分析16个关键基因在乳腺癌组织中的mRNA表达水平,结果显示,与正常乳腺组织相比,在乳腺癌组织中CXCL10、CXCL11呈高表达,ADRA2A、ADRA2C、CXCL2、DRD2、GABBR1、PTGER3呈低表达(P<0.01),见图6。通过Kaplan-Meier Plotter进行生存分析,结果显示,与相应基因低表达者相比,CXCL8、CXCL10、CXCL11高表达的乳腺癌患者生存率更低,ADRA2A、ADRA2B、CXCL2、CHRM2、CHRM4、DRD2、DRD3、GABBR1、HTR1B、OPRD1、OPRM1、PTGER3高表达的乳腺癌患者生存率更高(P<0.05),见图7。

图6 在正常乳腺组织与乳腺癌组织中16个关键基因的mRNA表达水平

图7 生存分析曲线图

2.4 关键基因映射与中药预测结果 在Coremine Medical数据库中对关键基因进行映射,筛选得到与关键基因相关的中药包括火麻仁、人参、白果、螺旋藻、眼镜蛇等。其中,火麻仁是关键基因CXCL2、CXCL8、PTGER3、DRD2、CHRM2、OPRM1映射的中药,人参是关键基因CXCL10、CXCL8、GABBR1、ADRA2A、DRD3、CHRM2映射的中药,白果为关键基因HTR1B、CXCL10、GABBR1、CXCL8、DRD2映射的中药,螺旋藻为关键基因HTR1B、ADRA2B、CXCL10、CXCL2、CXCL8映射的中药,眼镜蛇为关键基因CHRM4、CXCL10、CXCL11、CXCL8、DRD2映射的中药。

3 讨 论

目前,抑郁症与肿瘤的关系逐渐成为医学界研究的焦点[10]。相关文献报告,乳腺癌患者的抑郁症发生率达10.0%～63.5%[11-12]。近年来,有关乳腺癌患者并发抑郁症的发生、发展机制及治疗靶点尚无定论。利用基因芯片数据挖掘分析技术,可以更好地研究乳腺癌-抑郁症的生物学机制,进而发现疾病治疗的新靶点和新药物。

本研究共筛选出281个乳腺癌-抑郁症关联基因。GO功能富集分析表明,这些乳腺癌-抑郁症关联基因主要参与多种生物学过程,包括VEGFR信号通路、白细胞迁移、一氧化氮生物合成过程的正调控等。其中,VEGF是刺激血管生成最具代表性、作用最强的调节因子,可特异性作用于血管内皮细胞受体,促进血管内皮细胞的生长、迁移等[13]。肿瘤的生长和转移依赖于新血管的形成,VEGF作为血管生成的关键因子,可促进肿瘤血管的形成,增强肿瘤血管的通透性,并且能够诱导肿瘤淋巴管的生成,参与恶性肿瘤的发生和发展[14]。研究表明,VEGFR信号通路在乳腺癌的发生和发展过程中发挥了重要的调控作用[13,15-16]。此外,近年来有研究证实VEGF还是一种神经营养因子,可以保护神经、调节神经元功能及增强突触可塑性等[17]。虽然不少研究结果表明VEGF与抑郁症存在相关性[18-19],但目前临床研究尚未形成一致的相关性结果。故VEGF也为研究抑郁症的发病机制及治疗靶点拓展了新的视角。

本研究KEGG通路富集分析结果表明,乳腺癌-抑郁症关联基因涉及的信号通路包括FcεRI信号通路、癌症的蛋白多糖信号通路、Rap1信号通路、鞘磷脂信号通路等。FcεRI是一种异型多聚复合物,属于具有多条链的免疫识别受体[20]。IgE可与肥大细胞表面上的高亲和力受体FcεRI交联,促使肥大细胞产生炎性细胞因子,从而加重抑郁症[21]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3,TIM-3)在肿瘤组织中特异性表达。而肥大细胞可表达TIM-3,含有免疫受体酪氨酸激活基序的IgE受体可激活肥大细胞上TIM-3的表达[22-23]。故可推测FcεRI信号通路可能在乳腺癌与抑郁症之间有一定的介导作用。乳腺癌和抑郁症的发病过程都存在免疫炎症反应[24],而Rap1是Ras重要的调节剂和介质,可促进白细胞跨内皮迁移,从而参与免疫炎症过程[25]。此外,Rap1可以通过调节突触的结构和功能,影响个体的精神活动,进而影响个体的行为[26]。神经酰胺是所有鞘脂代谢的中心生物活性脂质,可参与鞘脂的合成,以及维持屏障功能和流动性[27-28]。同时,鞘脂作为致癌相关信号分子,被广泛应用于各种癌症模型的研究[29]。

本研究共筛选得到16个关键基因,进一步分析关键基因在乳腺癌组织中的表达量及其与生存情况的相关性,结果显示,8个关键基因在乳腺癌组织中显著表达,且除ADRA2外,其余关键基因与乳腺癌患者预后密切相关。其中,CXCL10和CXCL11在乳腺癌组织中表达上调,CXCL10和CXCL11高表达的乳腺癌患者预后较差;ADRA2A、CXCL2、DRD2、GABBR1和PTGER3在乳腺癌组织中表达下调,上述基因高表达的乳腺癌患者预后较好。趋化因子在细胞增殖、分化、迁移和侵袭中发挥调节作用,CXCL2、CXCL10、CXCL11均属于C-X-C基序趋化因子亚族。CXCL10及其受体CXCR3可表达于人乳腺癌细胞系,其可通过旁分泌回路建立肿瘤微环境,同时以自分泌方式增加癌细胞的迁移能力[30]。因此,乳腺癌患者的CXCL10和CXCL11高表达可促进乳腺癌扩散,缩短患者生存期,符合本研究生存分析的结果。有研究显示,乳腺癌患者的血清CXCL10、CXCL11呈显著性高表达[31],与本研究结果一致。CXCL2可募集中性粒细胞,从而发挥抗肿瘤或促肿瘤的作用。本研究结果提示CXCL2在乳腺癌组织中属于表达下调基因,但目前针对CXCL2及其编码蛋白在肿瘤中的调节作用及机制的研究较少,有待进一步探索[32]。ADRA2A为α2肾上腺素受体的编码基因,与乳腺癌等多种疾病相关[33-34]。此前,针对DRD2的研究主要集中在精神病学领域,但近年来越来越多研究发现其对肿瘤具有调控作用[35]。目前尚缺乏GABBR1、PTGER3在乳腺癌与抑郁症中作用的相关研究,今后需进一步研究以深入了解这些基因在乳腺癌与抑郁症中的作用。

本研究通过映射关键基因预测治疗乳腺癌与抑郁症的中药,结果显示,人参和火麻仁对接的乳腺癌-抑郁症关键基因最多。在中医中,乳腺癌又名“乳岩”,抑郁症为“郁证”,皆为情志不畅、肝脾失调所致。癌症会给患者造成严重的心理压力,忧思过度则气机郁滞,气机不畅反过来又会加重肝脾失调,二者互为因果。故中医多以疏肝健脾为乳腺癌-抑郁症的治疗原则[36-37]。人参甘温,大补元气,为治疗虚劳内伤的要药;火麻仁兼可滋润补虚。研究表明,人参具有减缓抑郁、抑制肿瘤细胞生长等作用,其主要成分是人参皂苷Rb3[38]。火麻仁含有大量中间体脂肪酸、大麻二酚及木脂素酰胺等,具有显著的抗肿瘤作用[39],但目前尚未有研究阐明人参与火麻仁在抗抑郁及肿瘤中的作用机制,这或可为相关的药理研究提供新思路。

综上所述,本研究基于生物信息学分析共筛选出了7个可能参与乳腺癌-抑郁症的发生和发展过程且与乳腺癌患者预后密切相关的基因,这些基因可能通过血管生成、免疫炎症反应等信号通路发挥作用。而人参、火麻仁等中药可为乳腺癌合并抑郁症患者的治疗提供新方向。本研究虽对后续研究有一定的参考价值,但研究结果缺乏临床试验及动物实验等支撑,因此未来仍需要深入研究以验证所得结论。