基于BDNF-SYN 轴探讨功能性电刺激对脑梗死大鼠学习记忆能力及认知能力的作用

胡琪苓，魏艳霞，贾东佩，汪宁，张辉

（1.南阳市中心医院康复医学科，河南 南阳 473000；2.郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450000）

脑梗死主要由动脉粥样硬化及高血压小动脉硬化导致，引发血管病变，血液成分改变，病死率约10%～15%，致残率极高且易复发[1]。脑源性神经营养因子（BDNF）是人脑中与空间学习相关的重要物质，神经营养因子中的一种，存在于人的神经系统中，由BDNF 基因合成[2]。突触素（SYN）是一种完整的膜糖蛋白，主要分布于大脑、脊髓、视网膜的突触前小泡，也出现在肾上腺髓质小泡及神经肌肉连接点，参与突触囊泡的形成和胞吐[3]。BDNF-SYN 轴在神经系统的发育、分化及突触可塑性中发挥重要作用[4]。脑梗死目前主要依靠药物进行降压、溶栓治疗，但预后较差，患者常有中枢神经系统异常引起的后遗症[5-6]。功能性电刺激通过低频脉冲电流刺激神经肌肉，同时刺激传入神经，将重复的运动信息传入中枢神经系统，在大脑皮层形成兴奋痕迹，逐渐恢复原有的运动功能，进行功能重建[7-8]，但在体内作用机制尚不明确。本研究通过闭塞大脑中动脉构建大鼠脑梗死模型，观察功能性电刺激对脑梗死大鼠学习记忆及认知能力的影响，并初步探讨其调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠，60 只，5 周龄，体质量250～350 g，购自山东斯科贝斯生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（鲁）2016-0001。

1.1.2 药物、试剂 10%水合氯醛（西安众森医药有限公司）、HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、SYBR Green 预混染料，反转录试剂盒（美国Thermo Fisher 公司），兔抗鼠BDNF、SYN 抗体（美国Abcam 公司），ECL 发光试剂盒（美国Biorad 公司），蛋白定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器 LC480 荧光定量PCR 仪（美国Roche公司），电泳系统（上海天能生命科技有限公司），Nano drop 2000 紫外分光光度计（美国Thermo Fisher 公司），化学发光成像仪（美国Bio-rad 公司），脑立体定位仪（美国stoelting 公司），CM1850切片机（日本Lecia 公司），E600 显微镜（日本尼康公司），Morris 水迷宫实验系统（北京众实迪创有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 60 只大鼠随机分为3 组，每组20只：假手术组（假手术+安慰刺激）[9]、对照组（脑梗死模型+安慰刺激）、电刺激组（脑梗死模型+功能性电刺激）。安慰刺激及功能性电刺激均通过治疗仪将电极置于前肢肌群，但安慰刺激组不连接电流，功能性电刺激组通过一定频率及强度电流刺激肌肉群。

1.2.2 模型制备 各组大鼠适应性喂养一周后，通过大鼠大脑中动脉闭塞法构建大鼠脑梗死模型。对照组、电刺激组大鼠均腹腔注射10%水合氯醛4 mL/Kg，麻醉后颈部备皮消毒，于颈部正中切开，切口长度约3 cm，分离颈部腺体组织后，沿肌肉纹理肌肉及筋膜，分离左颈总动脉（CCA）表面血管组织，暴露CCA，沿CCA 向上分离，于甲状腺水平处找到颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA），结扎CCA近端及ECA，微动脉夹短暂夹闭ICA 远端，离CCA分叉5 mm 处剪出切口，线栓插入后于切口处稍微结扎，松开动脉夹，线栓缓慢插入ICA，于切口处稍微打结防止滑脱，至有阻力停止，深度约20 mm，线栓至大脑中动脉起始部位，固定线栓后，缝合手术切口，90 min 后拔出线栓。术后大鼠注意保暖，肛温保持37 ℃，连续一周腹腔注射青霉素3 万单位/d。假手术组大鼠麻醉后仅分离血管，不插入线栓，其他操作相同。

手术清醒后，参照Longa 法[10]进行模型制备评分，1～3 分为造模成功，具体评分如下：0 分,无神经损伤症状;1 分,轻微神经损伤,左侧前爪伸展困难;2 分,中度神经功能损伤,中度局灶性病变，向左转圈;3 分,重度局灶性病变，神经功能损伤严重,向左倾倒;4 分,不能自主行走,精神意识严重缺失。

1.2.3 功能性电刺激干预 术后7 d，电刺激组采用治疗仪（Neuro Continence，英国Verity Medical 公司）对大鼠双侧前肢进行电刺激，每日两次，每次10 min，治疗周期21 d。大鼠俯卧固定后，电极分别置于前肢肌群近远端，刺激双侧前肢肌肉收缩，以产生伸腕伸指动作为准。频率100 Hz，脉宽250 μs，强度3～6 mA，电流通断比4 s∶6 s。假手术组、对照组接通相应的电极，不给电流刺激。

1.2.4 改良神经功能缺陷程度评分(mNSS)[11]分别于术后1、7、14、21、28 d 通过各组大鼠mNSS 评分，评估大鼠神经功能损伤情况。mNSS 评分主要包括运动实验、感觉实验、反射丧失和不正常运动、癫病及肌阵挛、肌张力障碍几项内容，总分18分，分数越高，神经功能损伤越严重，具体分级如下：13～18 分为严重损伤；7～12 分为中度损伤；1～6分为轻度损伤。

1.2.5 大鼠水迷宫实验 术后第28 d 开始水迷宫实验评估，前五天（D1、D2、D3、D4、D5）进行定位航行实验，第6 天进行空间探索实验。定位航行实验：每日固定时间点将大鼠分别从4 个象限放入水池，面部面向池体，记录大鼠爬上平台时间即为逃避潜伏期。若120 s 内未找到平台，则逃避潜伏期记为120 s。每日4 次，记平均值为当天测量结果。空间探索实验：第6 天撤去平台，于平台所在象限的对角象限面向池壁放入大鼠，记录2 min 内大鼠穿越平台次数，并分析大鼠在原平台象限所占时间及路程。

1.2.6 脑皮层梗死区病理学改变 行为学实验结束后，处死大鼠取脑组织，部分液氮冻存用于基因及蛋白含量检测，部分用于HE 染色。4%多聚甲醛固定72 h 后，PBS 冲洗干净，梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续5 μm 切片。常规苏木精-伊红染色，蒸馏水冲洗，梯度酒精水化，二甲苯脱蜡，中性树胶封片后在显微镜下观察脑皮质梗死区的病理变化。

1.2.7 脑皮层中BDNF、SYN mRNA 表达量检测取大鼠脑组织，匀浆仪研磨后，加入Trizol 提取组织总RNA，电泳鉴定结构后，测量RNA 含量，通过逆转录试剂盒反转成稳定cDNA 结构。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）反应体系：SYBR Premix Ex Taq 13 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 8.5 μL；反应条件：95℃预变性8 min；94℃变性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，重复45 个循环。GAPDH 为管家基因，通过2-△△CT法计算BDNF、SYN mRNA 相对表达量，上下游引物序列，见表1。

表1 引物序列

1.2.8 脑皮层中BDNF、SYN 蛋白表达量 取约100 mg 脑组织，加入RIPA 裂解液，液氮研磨后，10 000 r/min 4℃离心15 min，弃去沉淀，取上清。用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒测定蛋白含量。配制分离胶与浓缩胶后，取50 μL 蛋白样品等量加入上样缓冲液，98℃水浴3 min，用于蛋白电泳实验。电泳结束后湿转90 min，取PVDF 膜脱脂奶粉封闭2.5 h，加入稀释一抗（1∶8 000）4℃摇床孵育过夜，加入酶标二抗（1∶1 000 稀释），常温摇床孵育2 h，冲洗后加入根据ECL 显色试剂盒加入工作液，放入成像仪中曝光，将BDNF、SYN 与GAPDH 灰度值相比后计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计量资料均以（）描述，重复计量资料比较采用重复测量方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验；多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组mNSS 评分比较 与假手术组相比，对照组及电刺激组术后1、7、14、21、28 d mNSS 评分均升高（P＜0.05），其中电刺激组术后14、21、28 d mNSS评分低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠mNSS 评分比较

2.2 Morris 水迷宫实验评估学习记忆能力 与假手术组相比，对照组、电刺激组逃避潜伏期增加（P＜0.05），其中电刺激组逃避潜伏期均低于对照组（P＜0.05）。与假手术组相比，对照组、电刺激组原平台象限所占时间及路程降低，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中电刺激组原平台象限所占时间及路程、穿越平台次数均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3-4。

表3 各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较（s，n=20）

表4 各组大鼠空间探索实验结果比较（n=20）

2.3 脑皮层梗死区病理学改变（HE）假手术组脑组织神经细胞排列规则，结构清晰，形态正常，对照组神经细胞排列疏松紊乱，胞核皱缩溶解，形成深蓝密质块，细胞数量大面积减少，梗死区脑组织着色较浅，色差明显，电刺激组神经细胞部分排列紊乱，梗死面积缩小，部分胞核缩小，相比对照组脑皮质层损伤明显改善。见图1。

图1 各组大鼠脑皮质层病理学改变（HE×400）

2.4 各组大鼠脑皮层中BDNF、SYN mRNA 相对表达量 与假手术组相比，对照组、电刺激组BDNF、SYN mRNA 相对表达量降低（P＜0.05），其中电刺激组BDNF、SYN mRNA 相对表达量高于对照组（P＜0.05），见表5。

表5 各组大鼠BDNF、SYN mRNA 相对表达量比较

2.5 各组大鼠脑皮层中BDNF、SYN 蛋白相对表达量 与假手术组相比，对照组、电刺激组BDNF、SYN 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），其中电刺激组BDNF、SYN 蛋白相对表达量高于对照组（P＜0.05），见表6、图2。

图2 各组Western blot 蛋白条带图

表6 各组大鼠BDNF、SYN 蛋白相对表达量比较

3 讨论

脑梗死临床主要表现为偏身感觉障碍、共济失调、感觉异常等脑功能缺损综合征，研究表明脑梗死大鼠空间辨别能力下降，记忆能力减退并且学习能力退化[12]。BDNF-SYN 轴通过调控轴突及树突的生长及结构，调节中枢神经系统的可塑性及生长发育，从而对大脑的空间认知及学习能力产生重要影响[13]。功能性电刺激常用于运动神经元瘫痪、呼吸功能障碍等疾病，可以诱导肌肉非自主运动，从而恢复肌群运动能力[14]。研究表明[15-16]功能性电刺激可以增强脑卒中神经干细胞分化增殖，提高成纤维生长因子表达，改善大脑损伤，恢复肌肉群运动及平衡能力。目前功能性电刺激在脑梗死大鼠中的作用机制仍不明确，本研究通过探讨BDNF-SYN 轴阐述功能性电刺激修复脑梗死损伤的机制，为进一步阐明功能性电刺激在脑梗死大鼠中的作用机理奠定基础。

本研究发现，对照组及电刺激组术后1、7、14、21、28 d mNSS 评分均比假手术组升高，其中电刺激组14、21、28 d mNSS 评价均低于对照组。这提示造模后大鼠神经功能缺损，感觉迟缓，运动功能失常，功能性电刺激可以缓解神经损伤，改善脑梗死大鼠运动及反射功能。研究表明[17]功能性电刺激可以通过低频电刺激实现肌肉非自主运动，改善卒中后上肢肢运动功能。水迷宫结果显示，与假手术组相比，对照组及电刺激组逃避潜伏期延长、原平台所占时间及路程缩短、穿越平台次数减少，其中电刺激组原平台象限所占时间及路程、穿越平台次数均高于对照组，逃避潜伏期短于对照组，提示大鼠造模后空间认知能力、学习记忆能力均下降，功能性电刺激可能通过增加BDNF、SYN 的表达，在一定程度上恢复脑部损伤，改善脑梗死大鼠行为能力。有报道[18]显示功能性电刺激可以通过调控BDNF-SYN 轴激活钙信号传导，促进突起分化，增强神经元连接及突触传递，从而提高脑部海马区学习记忆能力。病理结果显示对照组神经细胞数量减少，排列杂乱，提示中动脉闭塞引起脑部梗死。电刺激组梗死面积明显减少，损伤明显改善。功能性电刺激可以修复梗死区域，改善细胞结构，减轻病理损伤。有报道[19]显示功能性电刺激可以增加细胞骨架蛋白表达，提高神经元细胞修复功能，促进病理损伤恢复。

本研究中，对照组、电刺激组BDNF、SYN mRNA 及蛋白相对表达量均比假手术组低，其中电刺激组高于对照组，提示功能性电刺激可以上调BDNF 及SYN 表达，增加神经元突触连接，修复梗死损伤。研究表明[20-21]，BDNF 可以防止神经元受损，改善神经元病理损伤，在神经元的生长发育、存活、分化中起重要作用，SYN 参与突触囊泡的形成与胞吐，在神经内分泌肿瘤中广泛表达。在血管性痴呆大鼠模型中，功能性电刺激可以通过调节大鼠BDNF 及SYN 表达，诱发快速兴奋性电位，提高神经元重塑功能，促进大脑结构恢复[22]。

综上所述，功能性电刺激可能通过调控BDNF-SYN 轴，逆转神经元损伤，改善受损脑部组织，为脑梗死的治疗提供理论基础和科学依据。