mNGS 在发热血液肿瘤患者血液病原体检测中的应用及细菌检出阳性预测模型构建

陈姝谕，雷坳錡，颜学兵

徐州医科大学附属医院感染性疾病与肝病科，江苏徐州 221000

宏基因组二代测序技术（mNGS）作为一种新兴的分子诊断技术，于2014 年首次用于感染性疾病的诊断，此后逐渐用于新发或罕见病原体的检测、感染性疾病的监测和预防、病原体耐药基因突变，并逐渐在不同人群、部位及样本类型的感染中展开探索。血液肿瘤患者是血流感染的高危人群，病死率高［1］。血液肿瘤患者最常见的临床症状是发热，其发热原因主要有二种，一是感染性疾病导致的发热，需早期诊断并准确选择抗菌药物；二是肿瘤本身导致的发热，需尽早抗肿瘤治疗。抗肿瘤治疗后伴随一定程度的免疫抑制，若此时合并感染，症状不典型且来势凶猛。这就要求临床医师抗肿瘤治疗前尽量识别并控制感染。血液肿瘤患者发热原因往往难以第一时间鉴别［2］。感染指标特异性不高［3］，传统病原体检测各有局限性。mNGS 不依赖培养，无偏好性，直接从样品中提取全部微生物的核酸进行鉴定，可作为免疫功能受损人群病原体检测的选择［4］。既往有研究纳入血、肺泡灌洗液、痰、尿等不同标本类型，泛标本探讨mNGS 在血液肿瘤中的应用价值［5］。目前尚缺乏mNGS针对血液肿瘤患者血流感染的大型诊断效能研究。本研究观察了外周血标本mNGS与常规检测技术病原体检出率的差异，探讨了发热血液肿瘤患者mNGS 细菌检出阳性的独立影响因素，并进一步构建了mNGS 细菌检出阳性预测模型，为mNGS检测时机的选择提供指导。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2020 年6 月1 日—2022 年10 月30日在徐州医科大学附属医院住院治疗的发热血液肿瘤患者104 例，男64 例（61.5%）、女40 例，年龄51.50（35.00，62.00）岁，血液病类型：白血病55 例、多发性骨髓瘤25 例、淋巴瘤20 例、再生障碍性贫血3例、骨髓增生异常综合征1例，合并症：肺部感染80例（76.9%）、低蛋白血症62 例（59.6%）、骨髓抑制85 例（81.7%），粒细胞缺乏症81 例（77.9%）。纳入标准：年龄≥14 岁；发热≥38 ℃；临床确诊血液肿瘤［诊断标准参照《血液病学诊断及疗效标准》（第4版）］且未合并实体肿瘤。排除标准：血液标本无法采集或采集量不能满足检测要求；临床资料不全者；实体肿瘤；自身免疫性疾病；已明确的非感染性发热。本临床研究满足赫尔基辛宣言的要求，经徐州医科大学附属医院伦理委员会批准，并免除研究对象的知情同意审查（XYFY2023-KL013-01）。

1.2 病原体检测方法 mNGS 检测方法：取成人外周血5 mL，以cfDNA 管（游离核酸保存管）6～37 ℃保存，运输不超过5 d。使用去宿主试剂盒并使用二代微生物破壁仪进行血液样本预处理，应用PCRfree技术无扩增建库，DNA/RNA 抽提建库试剂盒匹配illumine NGS 高通量测序平台进行宏基因组文库构建（包含 DNA/RNA 提取、RNA 逆转录、DNA/cDNA 片段化、末端补平、末端加 A、连接测序接头、文库纯化等步骤），然后应用NGS 文库定量试剂盒进行定量测试。病原微生物基因数据分析软件Gentellix 自动分析数据，去人源后通过人源指数识别真/假阴性结果并生成检测报告［6-7］。数据库覆盖25 000 + 微生物、2 000 + 耐药基因。血液样本均由杰毅生物有限公司进行DNA-mNGS 检测及生物信息分析。mNGS 阳性标准：以报告中详细结果列表为参考，若检出微生物片段仅含疑似或人体共生微生物群，则判定 mNGS 结果为阴性［8］。根据 mNGS是否检出细菌分为 mNGS 细菌检出组（n=40）和 mNGS细菌未检出组（n=64）。

常规检测技术方法：细菌常规检测技术包括需氧及厌氧的血培养［9］；真菌常规检测技术包括真菌培养、真菌/霉菌涂片、 G 试验、GM 试验［10-11］；病毒常规检测技术包括实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定血浆中 EBV 和 CMV 的 DNA 水平［12］；其他常规检测技术包括 PPD 试验、痰抗酸染色、血结核杆菌斑点试验（T-SPOT）、γ-干扰素释放试验（IGRAs）［13］； 十三项病原菌检测（具体包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺结核分枝杆菌复合群、肺炎支原体、肺炎衣原体）及十一项病原菌检测（具体包括肺炎支原体抗体、柯萨奇B 组病毒IgM 抗体、人呼吸道合胞病毒IgM 抗体、腺病毒IgM 抗体、A 型流感病毒IgM 抗体、B 型流感病毒IgM 抗体、人副流感病毒IgM 抗体、埃可病毒IgM抗体、EB病毒IgM抗体、血清淀粉样蛋白测定、结核分枝杆菌IgM 抗体、结核分枝杆菌IgG 抗体）等［14］。血液标本均留取患者空腹状态下的静脉血。以上实验室检测由徐州医科大学附属医院检验科检测人员严格按照质控程序完成。

1.3 观察指标及收集方法 从住院病历中收集mNGS 细菌检出组、mNGS 细菌未检出组临床资料，包括血常规、感染指标及合并的临床事件（肺部感染、低蛋白血症、骨髓抑制、粒细胞缺乏症）。感染指标包括超敏 C-反应蛋白（hs-CRP）、降钙素原（PCT）、血清铁蛋白（SF）、白介素-6（IL-6）、D-二聚体（D-Dimer）。肺部感染参照mNGS 检测前最近一次胸部CT 影像学结果［15］。低蛋白血症定义为血浆白蛋白< 30 g/L。抗肿瘤药物相关的骨髓抑制符合①同时符合②中任一条即可诊断：①有恶性肿瘤病史，近期进行抗肿瘤治疗，如化疗、靶向治疗等；②成人外周血白细胞< 4.0 ×109／L 为白细胞减少症；中性粒细胞绝对值<2.0×109／L 为中性粒细胞减少症；血红蛋白浓度降低至正常水平以下为贫血；血小板计数< 100 ×109／L为血小板减少症［16］。

1.4 统计学方法 采用 SPSS24.0 统计软件。计量资料经S-W检验正态性，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以 ［M（P25，P75）］表示，两组间比较采用 Mann-WhitneyU检验。计数资料用频次（%）表示，两组比较采用χ2检验或校正χ2检验或Fisher's确切概率法分析。采用二元 Logistic 回归进行单因素分析，将P<0.05的指标及临床事件纳入 Logistic 多因素分析，寻找发热血液肿瘤患者mNGS 细菌检出阳性的独立影响因素，并建立mNGS 细菌检出阳性预测模型。采用ROC 分析mNGS 细菌检出阳性预测模型的预测效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 发热肿瘤患者中，mNGS 检测技术与常规检测技术病原体检出率比较 发热肿瘤患者中，mNGS与常规检测技术细菌检出阳性分别为40（38.5%）、7例（6.7%），两者细菌检出阳性率比较，χ2=29.934，P<0.05；病 毒 检 出 分 别 为55（52.9%）、15 例（14.4%），两者病毒检出率比较，χ2=34.451，P<0.05；发热肿瘤患者中，mNGS 对分枝杆菌、支原体/衣原体/立克次体、真菌检出的例数分别为12（11.5%）、4（3.8%）、1 例（1%），常规检测技术分别为7（6.7%）、0、0例，两者比较，P均>0.05。

2.2 发热肿瘤患者中mNGS 细菌检出阳性的影响因素 发热肿瘤患者中mNGS 细菌检出组WBC、NEU、LY、hs-CRP、PCT、SF、IL-6、D-Dimer 分别为0.50（0.10，2.90）×109/L、0.16（0.00，1.88）×109/L、0.20（0.00，0.60）×109/L、130.20（39.13，218.95）mg/L、0.46（0.17，2.57）ng/mL、1 981.50（1 230.50，3 143.00）ng/mL、94.94（41.36，188.00）pg/mL、1.09（0.57，2.14）μg/mL，合并肺部感染、低蛋白血症、骨髓抑制、粒细胞缺乏症分别为37（92.5%）、33（82.5%）、37（92.5%）、34例（85.0%）；mNGS细菌未检出组WBC、NEU、LY、hs-CRP、PCT、SF、IL-6、D-Dimer分 别 为2.00（0.70，5.15）×109/L、0.82（0.09，2.81）×109/L、0.40（0.10，1.05）×109/L、43.40（9.20，92.70）mg/L、0.17（0.10，0.54）ng/mL、2 498.50（1 381.25，4 002.75）ng/mL、66.56（10.83，172.00）pg/mL、1.45（0.70，2.38）μg/mL，合并肺部感染、低蛋白血症、骨髓抑制、粒细胞缺乏症分别为43（67.2%）、29（45.3%）、48（75.0%）、47例（73.4%）。

以 mNGS 细菌检出阳性为因变量，上述各指标为自变量，行单因素 Logistic 回归分析。结果显示，hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血症、合并骨髓抑制是发热肿瘤患者中mNGS细菌检出阳性的影响因素，详见表1。

表1 发热肿瘤患者中mNGS 细菌检出阳性率影响因素的单因素 Logistic 分析结果

采用逐步向后回归法，引入标准为P<0.05，删除标准为P>0.10，建立多因素Logistic 回归模型。结果显示， hs-CRP 高 、存在肺部感染、合并低蛋白血症是 发热肿瘤患者mNGS 细菌检出阳性的独立影响因素（P<0.05），结果见表2。

表2 发热肿瘤患者中mNGS细菌检出阳性率影响因素的多因素 Logistic 分析结果

2.3 mNGS细菌检出阳性预测模型构建及效能验证结果 依据独立预测指标建立回归方程，得出发热肿瘤患者mNGS细菌检出阳性预测模型（PRE）=-4.768+ 0.01×hs-CRP + 1.619×肺部感染 + 1.271×低蛋白血症（合并肺部感染、合并低蛋白血症为1） 。PRE预测发热肿瘤患者mNGS 细菌检出阳性的ROC（图1）下面积AUC（95%CI）为 0.822（0.737～0.907）、Cut-off值0.415、约登指数0.551 灵敏度78.9%、特异度76.2%。hs-CRP预测发热肿瘤患者mNGS 细菌检出阳性的AUC（95%CI）为0.737（0.635～0.839）、Cut-off值147.400、约登指数0.395、灵敏度47.4%、特异度92.1%。合并肺部感染预测发热肿瘤患者mNGS细菌检出阳性的AUC（95%CI）为0.627（0.520～0.733）、Cutoff 值0.500、约登指数 0.253、灵敏度92.5%、特异度32.8%。合并低蛋白血症预测发热肿瘤患者mNGS 细菌检出阳性的AUC（95%CI）为0.686（0.583～0.789）、Cut-off值0.500、约登指数0.372、灵敏度82.5%、特异度54.7%。

图1 PRE及各独立影响因素对发热肿瘤患者mNGS细菌检出阳性预测的ROC

3 讨论

血液肿瘤患者是发生血流感染的高危人群，发热常提示感染存在。然而血液肿瘤患者合并的发热是感染性疾病导致，还是肿瘤自身导致，往往难以第一时间鉴别［2］。感染指标，如CRP、PCT等，特异性不强［3］。传统病原体检测，如血培养、抗原抗体检测、病毒定量检测等，各有其局限性。mNGS可作为 发热血液肿瘤患者寻找病原体的新选择。既往乔薇等［17］研究表明，mNGS鉴定病原体的阳性率显著高于血培养（47.9%比1.41%，P<0.05）。本研究发热血液肿瘤患者 mNGS 细菌检出阳性率显著高于血培养（38.5%比6.7%）；mNGS 病毒检出率显著高于传统病原学检测（52.9%比14.4%）。说明mNGS 比常规检测技术检出细菌及病毒更高效。

发热血液肿瘤患者由于治疗常需经验性应用抗生素，导致血培养阳性率进一步下降［18-19］。既往研究［20］收集免疫功能正常合并严重脓毒症表现的成年人 325例，结果显示抗菌治疗 120 min后，血培养阳性率较抗菌治疗前降低 12.0%。另一项研究［21］分析了 559 例脓毒症患者，接受抗生素治疗后血培养阳性率下降了22.9% 。GIRMENIA等［22］发现，革兰阴性菌血流感染是造血干细胞移植患者 4 个月时死亡率增加的独立影响因素。GILL等［23］研究显示，细菌血流感染使异体造血干细胞移植患者 1年总生存期显著下降 。既往研究［24］显示，当抗生素治疗后血培养结果阴性时，mNGS仍能够识别病原体。本研究104例 发热血液肿瘤患者均行经验性抗生素治疗，其常规检测技术阳性率仅6.73%，而mNGS 的 细菌检出阳性率38.5%，mNGS细菌血流感染检出率高于常规检测技术（血培养）。

血液肿瘤患者化疗导致骨髓抑制，免疫功能下降，使得WBC、NEU、LY 水平低下，极易发生感染。一旦细菌感染，hs-CRP、PCT 反应性升高［3］，而由于骨髓抑制等原因WBC、NEU 升高水平不理想。细菌感染，消耗血清中的蛋白质，导致白蛋白水平下降，甚至是低蛋白血症。本研究显示，hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血症、骨髓抑制是 mNGS细菌检出阳性的影响因素。hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血症是 mNGS 细菌检出阳性的独立影响因素，并以此建立发热血液肿瘤患者 mNGS细菌检出阳性的预测模型，以选择mNGS检测时机，提高检测效率。发热血液肿瘤患者常已行病毒定量检测，且经验性抗病毒治疗［19］。mNGS 扩大病毒检测范围，对临床病情和治疗影响不太大，故本研究并未针对病毒建立预测模型。

总之，在发热血液肿瘤患者中，mNGS 细菌及病毒检出率高于常规检测技术。综合hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血症成功建立了mNGS 细菌检出阳性预测模型。本研究尚存在以下局限性：单中心研究，纳入样本量相对有限，可能会影响结果的准确性；回顾性研究，样本采集前大多数患者存在抗菌药应用史，可能存在灭活病原菌的DNA，影响检测结果；本研究未进行RNA病原体检测。